一种人血浆冷沉淀凝血因子的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及血液制品领域，尤其涉及一种人血浆冷沉淀凝血因子的制备方法及其应用。


背景技术：

2.《全血及成分血质量要求》gb18469-2012中将冷沉淀凝血因子定义为“采用特定方法将保存期内的新鲜冰冻血浆在1℃-6℃融化后，分离出大部分的血浆，并将剩余的冷不溶解物质在1h内速冻呈固态的成分血”。第19版欧盟《血液成分的制备使用和质量保证指南》中的定义为：含有血浆中冷(不融)球蛋白组分的一种血液成分。该血液成分是通过对新鲜冰冻血浆的进一步分离和浓缩获得的。血浆冷沉淀凝血因子是临床广泛应用的一种浓缩血液成分，以补充凝血因子
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和纤维蛋白原为主要输注目的，主要用于儿童及成人轻型甲型血友病、血管性血友病、纤维蛋白原缺乏症及凝血因子
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缺乏症患者。目前普遍采用的血浆冷沉淀凝血因子(简称“冷沉淀”)制备方法是，将采集分离6-8小时之内的新鲜血浆速冻，并于数日后在低温条件下融化，冷沉淀会以固体状态存在于液体血浆中，采用融化过程中的虹吸法或融化后的低温离心法可将冷沉淀与液体血浆分离而得。
3.cn108976297a公开了一种冷沉淀的制备方法及其在人凝血因子
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生产中的应用，将-20℃的冷冻血浆原料经-5
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3℃升温冻融和0-4℃再升温融化后离心处理得冷沉淀，其工艺过程冻融次数较多，凝血因子生物活性会部分丧失，且反复冻融后纤维蛋白原易转化成纤维蛋白，凝血因子质量下降。
4.cn107281222a公开了一种制备冷沉淀凝血因子的方法，采用变频微波炉对冷冻血浆进行5℃的解冻，然而变频微波对血液中的白细胞有严重损伤效果，无法得到高质量的凝血因子。
5.cn103848886a公开了一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子
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制剂的方法，cn104086620a公开了一种制备冷沉淀的方法及其应用，上述两篇现有技术中均采用将冷冻血浆原料经低温冻融和二次升温融化的步骤，纤维蛋白原变性析出，生物活性丧失，多次升温极易引入杂质，破坏血浆成分。
6.综上，现有技术中的冷沉淀技术存在诸多弊端，开发一款步骤简洁、无需多次升温冻融的冷沉淀工艺十分有应用前景。


技术实现要素：

7.本发明的第一个方面提供了一种人血浆冷沉淀凝血因子的制备方法，制备方法包括：将液体血浆袋静置于-0.2-20℃下1-200h后，将液体血浆袋中的液体血浆的部分体积挤入空袋，即完成凝血因子与液体血浆的分离。
8.作为一种优选的实施方式，所述部分体积为液体血浆体积的5-75％。
9.作为一种优选的实施方式，所述液体血浆袋静置于-0.2-18℃下1-150h。
10.优选的，所述液体血浆袋静置于-0.2-15℃下1-72h。
11.更优选的，所述液体血浆袋静置于-0.2-14℃下1-48h。
12.更优选的，所述液体血浆袋静置于-0.2-14℃下1-24h。
13.更优选的，所述液体血浆袋静置于-0.2-14℃下1-16h。
14.更优选的，所述液体血浆袋静置于-0.2-14℃下16h。
15.更优选的，所述液体血浆袋静置于-5-14℃下16h。
16.更优选的，所述液体血浆袋静置于-8-14℃下16h。
17.更优选的，所述液体血浆袋静置于-10-14℃下16h。
18.更优选的，所述液体血浆袋静置于-11-14℃下16h。
19.更优选的，所述液体血浆袋静置于-13℃
±
1℃下16h。
20.迄今为止，国内外分离血浆冷沉淀的唯一方法就是将冰冻血浆在低温条件下(1℃-6℃)融化，并通过虹吸或低温离心等技术分离，然而在冰冻血浆通常为-25℃甚至更低，通过两次升温至1℃-6℃后，一方面两次冻融次数会导致血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白，直接导致凝血因子活性降低，另一方面，冷沉淀的低温不溶解是可逆的，当温度升高至1℃-6℃时，冷沉淀会重新溶解到血浆中，造成分离效率的降低。
21.申请人在多次实验中偶然发现，液体血浆处于过冷状态(-1℃-14℃)时，会出现大量冷不溶物，液体血浆加热至37℃时，冷沉淀消失，通过与常规方法制备的冷沉淀作电泳比对，发现其成分相近，初步确定过冷方法分离的冷不溶物就是血浆冷沉淀。
22.现有条件下，申请人经多次试验后发现，在本发明优选的温度范围内，液体血浆中仍然含有不冻结的血浆样本，随着温度继续降低，血浆冻结率会增高，由过冷状态逐渐变为冷冻凝结状态，因此选择最佳温度于-13℃
±
1℃，
23.因为冷沉淀是部分血浆蛋白在低温条件下溶解度降低而生成的，理论上讲，过冷状态下(-1℃-14℃)的血浆冷沉淀生成率应高于现有制备方法的1℃-6℃，实际情况是，过冷法保存3天以上制备的冷沉淀中纤维蛋白原含量，远高于现有方法，但凝血因子
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因活性降低而回收率低于现有方法，结合操作流程和时间的合理性，最终将过冷法制备冷沉淀的低温保存时间定为16小时。
24.作为一种优选的实施方式，所述空袋同液体血浆袋静置于相同环境。
25.作为一种优选的实施方式，所述环境为电机设备，电机设备的振速不大于0.28mm/s。
26.所述电机设备包括但不限于青岛海尔公司的冰箱，型号为dw-40l262。
27.作为一种优选的实施方式，所述空袋同液体血浆袋等容积。
28.作为一种优选的实施方式，所述空袋同液体血浆袋密闭相连。
29.现有技术中在凝血因子的分离沉降过程中多次转换容器，极易因实验条件和实验人员的疏忽造成血浆污染，操作风险高、实验条件苛刻，申请人一直致力于开发出一种操作简便、对实验环境要求稍低的制备工艺，因此本发明采用将空袋同液体血浆袋密闭相连的实验工艺，在特定温度和时间的静置结束后，只需轻轻对液体血浆袋进行按压，贴附于液体血浆壁上的冷凝因子便以固体状态留在袋内，其余液体血浆部分进入空袋，即完成冷沉淀与血浆的分离，全程无需将血浆暴露于环境内，最大程度上保证了血浆的质量安全。
30.本发明的第二个方面提供了一种人血浆冷沉淀凝血因子的制备方法在血液制品领域的应用。
31.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
32.1.本发明建立了一种全新的血浆冷沉淀凝血因子分离制备方法，将现有技术中至少两次升温冻融改为一次性升温，修正了现有的血浆冷沉淀凝血因子只能通过新鲜冰冻血浆低温融化制备的概念。
33.2.利用处于过冷状态的液体血浆也会出现大量冷不溶物的特点，在血浆理论冰点(-0.5℃-0.8℃)之下完成冷沉淀凝血因子与血浆的分离；冷沉淀分离温度更低，可在-13℃
±
1℃条件下实现固体冷沉淀与液体血浆的分离。
34.3.与现有技术中0-6℃的零上温度相比，本发明所制备的凝血因子能够有效避免冷沉淀后的复溶，冻融次数的减少，有效避免了纤维蛋白原的变形析出，显著提高了凝血因子的生物活性。
35.4.本发明中利用血浆的过冷状态这一特性，简化了现有技术中冷沉淀的制备工艺，使制备工艺在成本更低的情况下更易实现。
36.5.本发明中对空袋和液体血浆袋的放置环境和连接关系做了特殊限定，能够有效避免血浆在转移过程中的细菌污染。
37.6.本发明所述的制备方法不仅仅适合血浆中凝血因子的制备，还能够利用此技术研究低温状态下血浆蛋白的变化情况，实现更多科研意义。
38.本发明中的原料来源如下：
39.空袋为一次性使用去白细胞塑料血袋，购买自山东威高
40.冰箱购买自青岛海尔公司，型号为dw-40l262
附图说明
41.图1-2为实施例和对比例的电泳试验结果图。
具体实施方式
42.实施例1
43.当日采集并与红细胞分离的新鲜液体血浆200ml，取10ml液体血浆速冻并保存于-25℃冷库，作为初始原料血浆样本。将剩余190ml液体血浆直接放入-13℃
±
1℃冰箱中的专有容器中，冰箱的振速不大于0.28mm/s，平躺放置，16小时后取出，轻轻按压液体血浆袋，将液体血浆挤压至空袋中，作为冷上清，保留50ml液体血浆作为冷沉淀，速冻后保存于-25℃冷库，即制得冷沉淀凝血因子。冷上清称量记录体积，速冻后保存于-25℃冷库。
44.对比例1
45.当日采集并与红细胞分离的新鲜液体血浆200ml，取10ml液体血浆速冻并保存于-25℃冷库，作为初始原料血浆样本。剩余190ml液体血浆速冻并保存于-25℃冷库中，3日后于4℃
±
1℃水浴融化，离心法分离冷沉淀，液体血浆中保留50ml作为冷沉淀，剩余为冷上清，冷上清称量记录体积，速冻后保存于-25℃冷库，待测。冷沉淀速冻后保存于-25℃冷库。
46.性能测试
47.电泳测试：将实施例和对比例中所得的冷沉淀37℃水浴融化后，进行电泳试验，实施例结果如图1，对比例结果如图2。
48.纤维蛋白原浓度测试方法：采用clauss检测法
49.纤维蛋白原含量＝纤维蛋白原浓度
×
冷沉淀体积
[0050][0051]
ⅷ
因子浓度测试方法：采用一期测定法
[0052][0053] 实施例1对比例1纤维蛋白原(mg)186.02
±
22.72179.33
±
30.15纤维蛋白原回收率(％)37.51
±
7.4239.17
±
10.42
ⅷ
因子(iu)104.66
±
22.8889.56
±
31.25
ⅷ
因子回收率(％)46.62
±
5.5839.62
±
11.21