引物探针组合物及其在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用的制作方法

1.本发明属于病毒检测技术领域，特别涉及一种引物探针组合物及其在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用。


背景技术：

2.副流感病毒是属于副黏病毒属的一类有包膜的单股负链rna病毒，是一种常见的呼吸道感染病原体，主要引起婴幼儿及儿童严重的下呼吸道感染疾病，目前缺乏有效的治疗药物和病毒疫苗。
3.根据遗传性和抗原性，副流感病毒可以分为1型、2型、3型和4型，1
‑
3型副流感病毒是较为常见的引起婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，4型仅会引起症状较轻的婴幼儿呼吸道感染，且4型又可进一步分为4a型和4b型。副流感病毒所引起的感染症状和流感病毒较为相似，仅依靠临床症状及常规的检测方法进行病毒病原的确定并不可靠。因此早期快速对呼吸道病毒感染的病原进行诊断能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒药物提供依据，避免药物滥用。
4.为了解决上述问题，目前市面上已出现较多能够对副流感病毒1型、2型、3型和4型进行分型的试剂盒，如公开号为cn108676913a的中国发明专利申请公开的一种人副流感病毒核酸免提取基因分型检测试剂盒；也有少量能够对副流感病毒4a型和4b型进行分型的试剂盒，如公开号为cn108998574a的中国发明专利申请公开的一种人副流感病毒4型核酸检测试剂盒。
5.上述试剂盒中所采用的引物和探针虽然对副流感病毒4a型和4b型具有优异的检测灵敏度，但特异性仍旧较低，不能有效区分人副流感病毒1型和4型。


技术实现要素：

6.本发明的发明目的是提供一种引物探针组合物，该引物探针组合物能够对副流感病毒4a型和4b型进行分型检测，且特异性强、灵敏度高。
7.为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
8.一种引物探针组合物，其特征在于，至少包括用于检测副流感病毒4a型的引物和探针，以及用于检测副流感病毒4b型的引物和探针；
9.其中，所述的用于检测副流感病毒4a型的引物和探针包括：具有如seq no.10所示核苷酸序列的正向引物、具有如seq id no.11所示核苷酸序列的反向引物以及具有如seq id no.12所示核苷酸序列的探针；
10.所述的用于检测副流感病毒4b型的引物和探针包括：具有如seq no.13所示核苷酸序列的正向引物、具有如seq id no.14所示核苷酸序列的反向引物以及具有如seq id no.15所示核苷酸序列的探针。
11.本发明所述的引物探针组合物能够对副流感病毒4a型和4b型进行特异性分型，且
检测灵敏度高，据检测，该引物探针组合物对副流感病毒4a型的最低检出限为4.8
×
101copies/μl，对副流感病毒4b型的最低检出限为5.2
×
101copies/μl，灵敏度高；同时该引物探针组合物能够特异性地对副流感病毒4a型和4b型进行分型，与副流感病毒1型、2型或3型均不存在交叉反应，特异性极强，能够快速、准确地对副流感病毒进行分型检测。
12.作为优选，上述的引物探针组合物还包括用于检测副流感病毒1型、2型和3型中至少一种的引物和探针。
13.作为优选，在上述的引物探针组合物中，用于检测副流感病毒1型的引物和探针包括：具有如seq no.1所示核苷酸序列的正向引物、具有如seq id no.2所示核苷酸序列的反向引物以及具有如seq id no.3所示核苷酸序列的探针。
14.作为优选，在上述的引物探针组合物中，引物探针组合物用于检测副流感病毒2型的引物和探针包括：具有如seq no.4所示核苷酸序列的正向引物、具有如seq id no.5所示核苷酸序列的反向引物以及具有如seq id no.6所示核苷酸序列的探针。
15.作为优选，在上述的引物探针组合物中，引物探针组合物用于检测副流感病毒3型的引物和探针包括：具有如seq no.7所示核苷酸序列的正向引物、具有如seq id no.8所示核苷酸序列的反向引物以及具有如seq id no.9所示核苷酸序列的探针。
16.本发明中，不同组的引物和探针之间均互不干扰，且与非目标病毒之间也不存在交叉反应，特异性强。
17.作为优选，在上述的引物探针组合物中，引物探针组合物用于检测副流感病毒1型、2型、3型、4a型和4b型的各探针均具有荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团为fam、cy5、rox、vic或tamra且各探针所具有的荧光报告基团均不相同；所述的荧光淬灭基团为bhq
‑
1或bhq
‑
2。
18.以用于检测副流感病毒1型、2型3型、4a型和4b型的探针中的荧光报告基团依次为fam、cy5、rox、vic和tamra为例，在经多重rt
‑
qpcr后，若fam通道ct值＜38且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒1型感染；若cy5通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒2型感染；若rox通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒3型感染；若vic通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒4a型感染；若tamra通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒4b型感染。
19.基于上述引物和探针组合物的特异性和灵敏度，本发明还提供了上述的引物探针组合物在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用；以及，一种副流感病毒4型的实时荧光定量pcr检测试剂盒，该试剂盒中即含有上述的引物探针组合物；该引物探针组合物可以仅包含用于检测副流感病毒4a型和4b型的引物和探针，还可以包含用于检测副流感病毒1型、2型和3型中至少一种的引物和探针。
20.作为优选，上述的副流感病毒4型实时荧光定量pcr检测试剂盒还含有pcr反应液和rt
‑
qpcr酶系，所述的pcr反应液包括dntps、dutp、mg
2+
和缓冲液；所述的rt
‑
qpcr酶系包括ung酶、逆转录酶和热启动dna聚合酶。
21.本发明中，dutp和ung酶组成了pcr反应体系中的防污染体系，该dutp
‑
ung酶防污染体系能够有效避免气溶胶污染影响pcr结果，从根本上避免假阳性结果的出现。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
23.(1)本发明所述的引物探针组合物能够对副流感病毒4a型和4b型进行特异性分型，且检测灵敏度高，据检测，该引物探针组合物对副流感病毒4a型的最低检出限为4.8
×
101copies/μl，对副流感病毒4b型的最低检出限为5.2
×
101copies/μl，灵敏度高；同时该引物探针组合物能够特异性地对副流感病毒4a型和4b型进行分型，与副流感病毒1型、2型或3型均不存在交叉反应，特异性极强，能够快速、准确地对副流感病毒进行分型检测。
24.(2)本发明的实时荧光定量pcr试剂盒对副流感病毒进行分型检测的周期短、灵敏度高、分型效果好，并且采用了dutp
‑
ung酶防污染体系，该dutp
‑
ung酶防污染体系能够有效避免气溶胶污染影响pcr结果，从根本上避免假阳性结果的出现。
附图说明
25.图1为本发明用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物对副流感病毒1型的检测灵敏度测试结果；
26.其中，cycle表示循环数，δrn表示荧光强度；下同；
27.图2为本发明用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物对副流感病毒2型的检测灵敏度测试结果；
28.图3为本发明用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物对副流感病毒3型的检测灵敏度测试结果；
29.图4为本发明用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物对副流感病毒4a型的检测灵敏度测试结果。
30.图5为本发明用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物对副流感病毒4b型的检测灵敏度测试结果。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
32.实施例1
33.分别针对副流感病毒1型hn基因、副流感病毒2型l基因、副流感病毒3型l基因、副流感病毒4a型l基因和副流感病毒4b型n基因设计特异性引物和探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；获得的四组引物和探针的核苷酸序列信息见表1。
34.表1引物和探针组合物序列信息
[0035][0036]
其中，副流感病毒1型hn基因扩增产物长度为90bp，副流感病毒2型l基因扩增产物长度为137bp，副流感病毒3型l基因扩增产物长度为128bp，副流感病毒4a型l基因扩增产物长度为90bp，副流感病毒4b型n基因扩增产物长度为115bp。
[0037]
采用表1所示的引物探针组合物制备用于副流感病毒分型检测的多重rt
‑
qpcr试剂盒，该试剂盒中包含有rt
‑
qpcr反应液、引物探针组合物、rt
‑
qpcr酶系、阳性对照以及阴性对照，其中，引物探针组合物的组成如表2所示，rt
‑
qpcr反应液的试剂组成如表3所示，rt
‑
qpcr酶系的组成如表4所示；阳性对照为含有副流感病毒1型hn基因、副流感病毒2型l基因、副流感病毒3型l基因、副流感病毒4a型l基因和副流感病毒4b型n基因的重组假病毒；阴性对照为rnase
‑
free h2o。
[0038]
表2用于副流感病毒分型检测的引物和探针组成(50人份)
[0039][0040][0041]
表3 rt
‑
qpcr反应液试剂组成(50人份)
[0042][0043]
表4 rt
‑
qpcr酶液各组分配比(50人份)
[0044][0045]
采用已通过高通量测序验证后确诊的副流感病毒阳性样本s1
‑
s6(其中，s1样本为副流感病毒1型阳性患者，s2为副流感病毒2型阳性患者，s3为副流感病毒3型阳性患者，s4为副流感病毒4a型阳性患者，s5为副流感病毒4b型阳性患者)和阴性样本s6对上述多重rt
‑
qpcr试剂盒对副流感病毒的分型检测效果进行验证，验证方法为：
[0046]
(1)核酸提取：在全自动核酸提取仪上，使用核酸提取试剂同时对样本s1～s6进行核酸自动提取，将完成提取的核酸样本置于
‑
20℃保存备用；
[0047]
(2)多重rt
‑
qpcr：先根据表5配制rt
‑
qpcr反应体系，再根据表6所示的反应程序进行多重rt
‑
qpcr，获得荧光扩增曲线；
[0048]
表5多重rt
‑
qpcr反应体系
[0049]
rt
‑
qpcr反应体系加样量(μl)rt
‑
qpcr反应液10引物/探针组合物4rt
‑
qpcr酶液1待测样本/阴阳性对照5总体积20
[0050]
表6多重rt
‑
qpcr反应程序
[0051][0052]
(3)病毒分型：根据以下判断标准对样本中所含副流感病毒的血清型进行判断，判断结果见表7。
[0053]
根据多重rt
‑
qpcr扩增曲线进行阴阳性判断，阴性结果判断条件：所有荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct；阳性结果判断条件：若fam通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副
流感病毒1型感染；若cy5通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒2型感染；若rox通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒3型感染；若vic通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒4a型感染；若tamra通道ct值＜38，且扩增曲线呈典型s型，其余荧光信号通道ct值≥38或显示为undetermined/no ct，则样本为副流感病毒4b型感染。
[0054]
表7 s1～s6样本在各个荧光通道中的ct值
[0055]
样本编号famroxcy5victamras126.09no ctno ctno ctno cts2no ctno ct28.14no ctno cts3no ct29.34no ctno ctno cts4no ctno ctno ct25.67no cts5no ctno ctno ctno ct26.09s6no ctno ctno ctno ctno ct
[0056]
由表7的ct值检测结果可以判断为：s1样本感染了副流感病毒1型，s2样本感染了副流感病毒2型，s3样本感染了副流感病毒3型，s4和s5样本感染了副流感病毒4型，而s6样本未感染副流感病毒；该判断结果与实际情况相符，表明本发明的试剂盒能够准确的判定副流感病毒阳性患者所感染副流感病毒的具体血清型。
[0057]
实施例2
[0058]
将测定浓度和纯度后的包含副流感病毒1型hn基因、副流感病毒2型l基因、副流感病毒3型l基因、副流感病毒4a型l基因和副流感病毒4b型n基因的各阳性质粒分别做10倍梯度稀释，得到从2.4
×
101～2.4
×
106copies/μl共6个稀释度的阳性质粒作为标准模版。根据实施例1中表5所示配制pcr反应体系，根据表6所示反应程序进行多重rt
‑
qpcr反应，获得荧光扩增曲线(如图1、图2、图3、图4和图5所示)，绘制标准曲线并确定最低检出限。由图1、图2、图3、图4和图5所示，在浓度1.2
×
102～1.2
×
108copies/μl范围内，本发明的试剂盒对副流感病毒1型hn基因、副流感病毒2型l基因、副流感病毒3型l基因、副流感病毒4型f基因进行扩增获得的荧光扩增曲线均呈典型的s型曲线，且在不同浓度下获得的各荧光扩增曲线间距均匀，具有良好的相关性，其线性方程可以解析为：
[0059]
副流感病毒1型hn基因：y＝
‑
3.590logx+36.852(r2＝0.999)；
[0060]
副流感病毒2型l基因：y＝
‑
3.672logx+38.306(r2＝0.999)；
[0061]
副流感病毒3型l基因：y＝
‑
3.676logx+37.789(r2＝0.999)
[0062]
副流感病毒4a型l基因：y＝
‑
3.550logx+37.758(r2＝0.999)；
[0063]
副流感病毒4b型、n基因：y＝
‑
3.810logx+42.751(r2＝0.999)。
[0064]
从上述线性方程中，可以得出本发明的试剂盒对各副流感病毒血清型的最低检出限分别为：
[0065]
流感病毒1型hn基因：1.2
×
101copies/μl；
[0066]
副流感病毒2型l基因：4.5
×
101copies/μl；
[0067]
副流感病毒3型l基因：3.2
×
101copies/μl；
[0068]
副流感病毒4a型l基因：4.8
×
101copies/μl；
[0069]
副流感病毒4b型n基因：5.2
×
101copies/μl。
[0070]
同时，通过对四个荧光通道的灵敏度比较来看，四个荧光通道的扩增效率相近，引物间相互干扰少，试剂盒性能稳定。