HEG1基因突变体及其应用的制作方法

heg1基因突变体及其应用
技术领域：
1.本发明属于基因工程技术领域，涉及heg1基因突变体及其应用。具体涉及分离的编码heg1突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感扩张型心肌病的生物样品的方法以及用于筛选易感扩张型心肌病的生物样品的试剂盒。


背景技术：

2.扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，dcm)是一种以心腔(左心室和/或右心室)扩张、心肌收缩功能受损为主要特征的原因不明的心肌疾病。目前，dcm已成为心力衰竭的最常见原因之一，并且是全世界心脏移植的最常见适应症。据报道，在18岁以下人群中,心肌病的发病率约为1.1/100,000
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1.5/100,000。其中儿童dcm发病率约为0.58/100,000，在各类型心肌病中约占66％，约70％
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90％的患儿在确诊时以心力衰竭为主要表现，且dcm患儿的5年生存率仅为40％，是导致青少年和儿童致死的主要原因之一。因此，加强临床对早期dcm的认知与管理势在必行。心肌病尚无特定病因治疗,治疗上仍以减轻患者症状和防治并发症为主。
3.目前基因突变诱导dcm的机制尚未完全明确,仍缺乏从分子、细胞到临床表型的精确致病机制,探索针对基因水平的治疗手段有望成为未来解决dcm的关键。在大型队列中的关联分析和全基因组关联研究(gwas)已经成功筛选出疾病相关的基因及遗传变异。到目前为止，已经在近60个基因中鉴定了400多种致病变异，其中大多为编码心肌细胞骨架和功能以及其与肌节和细胞核的连接中起作用的蛋白质。已有报道显示接受基因筛查的dcm患者已有数千人,且有基因型
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表型关联的研究，研究基因多集中在ttn，lmna，pln，rbm20，mybpc3，myh7，tnnt2或tnni3等。其中ttn截短突变是dcm的常见原因，发生在大约25％的特发性扩张型心肌病家族性病例和18％的散发病例中，突变携带者的临床表现与症状，发病率和死亡率与非携带者相似。lmna突变大约能解释5
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10％不等的dcm病例，且与心脏猝死的高风险相关，约有一半的突变携带者可发生室性心律失常。然而，目前仅在不到三分之一的病例中可以发现遗传病因，且只有少量的突变可以在另外的家系或者无血缘关系的病人中重复检出。越来越多研究证实dcm的核心致病基因，但是整个的基因遗传图谱仍不够完善。
4.因此，有针对性的对dcm开展遗传学研究，明确致病基因及其致病机制，对dcm患者的遗传咨询和个体化防治具有潜在的临床意义，为dcm早期诊断和有效治疗提供研究方向和新的理论依据，也将在实践上为研发治疗dcm的特效药物提供新的分子靶点。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点，提供一种扩张型心肌病的致病基因的突变体。
6.为了实现上述目的，本发明提出一种分离的编码heg1突变体的核酸，与seq id no：1相比，该核酸具有选自c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc的至少一种突变。本发明确定了该heg1突变体与扩张型心肌病的发病密切相关，从而通过检测该
新突变在生物样品中是否存在，能够有效地检测生物样品是否易感扩张型心肌病。
7.本发明还提供一种分离的编码heg1突变体多肽，该多肽与seq id no：2相比，具有选自p.ala27del和p.ser763_ser768dup的至少一种突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，能够有效地检测生物样品是否易感扩张型心肌病。
8.本发明还提供一种筛选易感扩张型心肌病的生物样品的方法。该方法包括以下几个步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与seq id no：1相比，具有c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变是所述生物样品易感扩张型心肌病的指示。通过根据本发明的筛选易感扩张型心肌病的生物样品的方法，能够有效地筛选易感扩张型心肌病的生物样品。
9.本发明还提供一种用于筛选扩张型心肌病的生物样品的试剂盒，该试剂盒含有：适于检测heg1基因突变体的试剂，其中所述heg1基因突变体与seq id no：1相比，具有c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变。利用根据本发明的试剂盒，能够有效地筛选易感扩张型心肌病的生物样品。
10.本发明与现有技术相比，发明人首次确定了heg1基因为扩张型心肌病的致病相关基因，并通过全基因组测序联合候选基因突变验证的方法确定了致病基因的两个突变位点，为扩张型心肌病的检测提供了新的方向。
附图说明：
11.图1为本发明涉及的实施例1的扩张型心肌病患者家系图谱示意图。
12.图2为本发明涉及的实施例1扩张型心肌病先证者及其父母heg1基因c.78_80delgcc突变位点的sanger测序验证峰图，其中a为先证者；b为先证者父亲；c为先证者母亲。
13.图3为本发明涉及的实施例1扩张型心肌病先证者及其父母heg1基c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc突变位点的sanger测序验证峰图，其中a为先证者；b为先证者母亲；c为先证者父亲。
14.图4为本发明涉及的实施例1的慢病毒敲低小鼠心肌细胞中heg1的表达，heg1及其扩张型心肌病标记分子anp、bnp在mrna水平的表达。
具体实施方式：
15.下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
16.实施例1：
17.本实施例涉及一种分离的编码heg1基因突变体的核酸，与seq id no.1相比，该核酸具有选自c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc中的至少一种突变。所述编码heg1基因突变体的核酸是指与编码heg1基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受限制，可以是任何包含与heg1基因突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于dna、rna或cdna。
18.所述核酸，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本技术方案中，虽然只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及seq id no：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦
然。
19.该编码heg1突变体的核酸，是发明人通过全基因组测序联合突变验证的方法确定的扩张型心肌病的致病基因上的突变。虽然有关于扩张型心肌病的基因的报道，但本发明人首次证实了heg1基因与扩张型心肌病有关的的突变位点，在现有技术中并未被提到。野生型的heg1基因的cdna序列如seq id no：1所示，共含有4146个碱基。野生型heg1基因编码的蛋白含有1381个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
20.heg1基因突变体与seq id no：1相比，具有选自c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc中的至少一种突变，即相对野生型heg1基因，本发明的heg1基因突变体的cdna中第78
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80位发生gcc碱基删除和/或第2286位插入ctcttcctcctcctcctc重复序列，由此所编码的产物与蛋白(seq id no：2)相比，具有选自p.ala27del和p.ser763_ser768dup中的至少一种突变。
21.野生型heg1的cdna核苷酸序列(4146nt)如seq id no：1所示，其编码的氨基酸序列(1381aa)如seq id no：2所示。
22.其中，具有c.78_80delgcc突变的heg1基因突变体的cdna序列seq id no：3所示，其编码的具有p.ala27del突变的蛋白质的氨基酸序列(1380aa)如seq id no：4所示。
23.具有c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc突变的heg1基因突变体的cdna序列如seq id no：5所示，其编码的具有p.ser763_ser768dup突变的蛋白质的氨基酸序列(1387aa)如seq id no：6所示。
24.本实施例还涉及一种分离的多肽，与seq id no.2相比，该分离的多肽具有选自p.ala27del和p.ser763_ser768dup中的至少一种突变。该多肽是由前所述的分离的编码heg1突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，能够有效地检测生物样品是否易感扩张型心肌病，也可以通过检测这些多肽在生物体中的存在，有效地预测生物体是否易感扩张型心肌病。
25.本实施例还涉及一种筛选易患高胆固醇血症的生物样品的方法。该方法包括以下步骤：
26.s1、从生物样品提取核酸样本：所述生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品heg1是否存在突变的核酸样本即可；生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患扩张型心肌病的生物样品的效率。这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中heg1是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组dna，也可以是该全基因组中包含heg1编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总rna，也可以是从生物样品中提取的mrna。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患高胆固醇血症的生物样品的效率。另外，针对采用rna作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本进一步包括：从生物样品提取rna样本，优选rna样本为mrna；以及基于所得到的rna样本，通过反转录反应，获得cdna样本，所得到的cdna样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用rna作为核酸样本筛选易患扩张型心肌病的生物样品的效率；
27.s2、在得到核酸样本之后，对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列；确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。可以通过测序
的方法，确定核酸样本的核酸序列。用于进行测序的方法和设备并不受特别限制，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术；利用选自hiseq2000、solid、454、abi3730和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序；由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因此能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率，从而能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度；由此，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及所得到的核酸序列文库进行测序，以便获得多个测序数据构成的数据结果；
28.需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应heg1的编码序列即可。
29.s3、在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与seq id no：1的序列相比对，如果在所得到的核酸序列中具有c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变，则指示生物样品易患扩张型心肌病；由此，通过根据本发明实施例的筛选易患扩张型心肌病的生物样品的方法，可以有效地筛选易患高胆固醇血症的生物样品；其中，对核酸序列与seq id no：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作。
30.若未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
31.实施例2：确定扩张型心肌病致病基因及突变位点
32.1、样本收集：
33.发明人收集到1个扩张型心肌病家系，如图1所示，根据患者口述，该家系成员共3人，其中患者1人(先证者)，正常人员2人。
□
表示正常男性，
○
表示正常女性，
●
表示患病女性，
▇
表示患病男性，
↗
表示先证者。参与本发明研究的共3人(先证者及其父母)，所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。发明人采集获得上述扩张型心肌病患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本。
34.2、全基因组测序
35.发明人利用the mgieasy
tm
dna library prep kit v1结合bgiseq
‑
500高通量测序技术对上述家系中的患者及其父母进行全基因组测序，具体步骤如下：
36.2.1样品制备
37.分别取上述患者及其父母的外周血，使用allprep dna/rna/mirna通用试剂盒提取外周血dna。使用qubit进行定量，保证每个dna样本至少2μg进行全基因组测序。
38.2.2文库构建及测序
39.使用e220 covaris仪器将dna样本随机打断成150
‑
200bp的片段，随后按照制造商使用说明书，用ampure xp beads选择dna片段大小，然后进行末端修复、磷酸化和a尾反应。
将bgiseq
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500平台特异性接头连接到a
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尾片段上，纯化连接片段，用pcr扩增。最后，进行循环化，生成单链dna环。定量鉴定后，对文库进行测序。
40.3、变异检测、注释及数据库比较
41.对先证者及其父母进行全基因组测序，测序数据使用burrows
‑
wheeler比对工具与hg19基因组参考匹配，并使用snpeff 3和dbsnp数据库进行注释。首先通过dbsnp数据库、exac、hapmap数据库、1000genomes、100个中国健康成人本地数据库筛选所有已识别的变异体，并删除健康人群maf＞0.01的变异体，然后将所有过滤后的变异与omim和cgd数据库进行比较，以确定与疾病表型相关的基因变异。
42.由此，发明人发现患者在heg1基因上存在c.78_80delgcc和c.2286_2303
43.dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变；进一步，通过对扩张型心肌病患者家系进行疾病共分离，患者父亲携带c.78_80delgcc杂合突变，患者母亲携带c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc杂合突变，即序列与表型在该家系内表现为共分离。因此，发明人初步判断该突变是遗传性扩张型心肌病的致病位点；
44.4、sanger法测序验证
45.分别对实施例2中所述分遗传性扩张型心肌病患者家系中的患者及其父母(正常人)的heg1基因进行测序；根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证heg1基因的c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变与遗传性扩张型心肌病之间的相关性。具体方法步骤如下：
46.1、dna提取
47.按照实施例1中所述方法，分别提取上述扩张型心肌病患者及其父母的外周血基因组dna，备用。
48.2、引物设计及pcr反应
49.参考人类基因组序列数据库grch37.1/hg19，设计得到具有seq id no:7
‑
8所示的核苷酸序列的针对c.78_80delgcc突变位点的特异性引物，以及具有seq id no:9
‑
10所示的核苷酸序列的针对c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc突变位点的特异性引物，具体见下表。
[0050][0051]
按照本领域常规方法以所提取的dna为模板与上述特异性引物进行pcr反应，并将纯化的pcr产物进行测序。
[0052]
3、测序将步骤2中获得的患者及其父母的pcr扩增产物进行dna测序。基于测序结果，对上述各样本进行heg1基因编码序列比对。结果发现，患者携带c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变，而表现正常的患者母亲仅携带c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc杂合突变，患者父亲仅携带c.78_80delgcc杂合突变。
进一步我们以正常体检者为对照，按照上述方法提取外周血dna并进行pcr扩增，pcr扩增产物dna测序结果发现正常体检者均无上述两种突变位点。由此证实heg1基因的c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变是扩张型心肌病的致病突变。
[0053]
4、基因突变体功能验证
[0054]
基于上述测序结果，构建慢病毒干扰系统，对小鼠心肌细胞fmc84细胞进行感染，干扰细胞中heg1的表达。在heg1的表达降低的基础上，应用实时荧光定量技术检测fmc84细胞内扩张型心肌病标记基因anp和bnp在转录水平上的表达。与对照组相比，慢病毒干扰使heg1表达下调89％，同时anp和bnp分别上调0.6倍和2.9倍(图4)。由此进一步证明heg1基因突变是扩张型心肌病的致病基因。
[0055]
实施例3：检测试剂盒
[0056]
制备一检测试剂盒，其包含适于heg1基因突变体的引物(与seq id no.1相比，所述heg1基因突变体具有c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc复合杂合突变)，用于筛选易感扩张型心肌病的生物样品，其中这些引物包括seq id no.7
‑
10所示的heg1基因特异性引物
[0057]
利用上述试剂盒筛选易感扩张型心肌病的生物样品的具体步骤为：按照实施例2中步骤1所述方法提取待测者dna，以所提取的dna为模板与上述特异性引物进行pcr反应，并按照本领域常规方法对pcr产物进行纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的的序列是否同时具有c.78_80delgcc和c.2286_2303dupctcttcctcctcctcctc突变，从而有效地检测待测者是否易患扩张型心肌病。