一种游离DNA的提取方法

一种游离dna的提取方法
技术领域
1.本发明属于提取分离技术领域，具体涉及一种游离dna的提取方法。


背景技术：

2.mandel等人在1948年首次报道了血浆中游离dna(cell free dna，cfdna)的存在，它是一种胞外dna，主要是由单链或双链dna以及单链与双链dna的混合物组成。健康人和肿瘤患者外周血中均存在cfdna，而肿瘤患者外周血中cfdna的含量约为健康人的10倍以上。临床研究表明，cfdna能有效反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息，与肿瘤组织的基因信息呈一定相关性。通过对血浆cfdna测序检测肿瘤相关的基因拷贝数变化、甲基化变化、核苷酸突变变化、染色体重排变化等，可以用于临床诊断、用药指导和检测肿瘤发生情况等等。因此，提取高质量的cfdna是对其进行精准分析的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续实验的成败。
3.核酸提取技术经历了从第1代化学法，到第2代吸附柱法，以及近年来发展起来的第3代磁珠法，其提取技术和效率不断地改进优化。目前核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解，核蛋白复合体的变性，核酸酶的灭活以及污染物的去除。如何提供一种简单、快速、高效分离cfdna的方法是一个值得研究的问题。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种，以克服现有技术的不足。
5.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
6.本发明实施例提供了一种游离dna的提取方法，其包括：
7.(1)将待处理样品、裂解液和磁珠混合进行裂解处理，获得裂解后的样品，其中所述裂解液包括异硫氰酸胍、聚氧乙烯醚brij58、naac
‑
hac缓冲液、异丙醇及水；
8.(2)采用洗涤液、乙醇溶液对步骤(1)所获裂解后的样品进行洗涤处理，获得洗涤后的样品，其中所述洗涤液包括异硫氰酸胍及tris
‑
hcl缓冲液；
9.(3)将步骤(2)所获洗涤后的样品与洗脱液混合进行洗脱处理，获得游离dna，其中所述洗脱液包括te缓冲液。
10.进一步的，所述te缓冲液的ph值为10。
11.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过裂解、洗涤、洗脱3个步骤即可提取游离dna，方法更为高效便捷，同时本发明中的裂解液既能很好的将蛋白质破坏，又形成了高盐环境，使得游离dna与磁珠更好地结合。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，
还可以根据这些附图获得其他的附图。
13.图1是本发明实施例1制备的游离dna的分子量测定的结果图。
具体实施方式
14.鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.本发明实施例的一个方面提供了一种游离dna的提取方法，其包括：
16.(1)将待处理样品、裂解液和磁珠混合进行裂解处理，获得裂解后的样品，其中所述裂解液包括异硫氰酸胍、聚氧乙烯醚brij58、naac
‑
hac缓冲液、异丙醇及水；
17.(2)采用洗涤液、乙醇溶液对步骤(1)所获裂解后的样品进行洗涤处理，获得洗涤后的样品，其中所述洗涤液包括异硫氰酸胍及tris
‑
hcl缓冲液；
18.(3)将步骤(2)所获洗涤后的样品与洗脱液混合进行洗脱处理，获得游离dna，其中所述洗脱液包括te缓冲液。
19.在一些较为具体的实施方案中，所述样品、裂解液与磁珠的体积比为100～200∶150～250∶0.5～3。
20.进一步的，包含所述磁珠的溶液中磁珠的浓度为10～100mg/ml。
21.进一步的，所述提取方法还包括：将步骤(1)所获裂解后的样品于转速为1000～3000rpm的条件下离心处理1～2min，之后在磁场作用下进行分离处理。
22.在一些较为具体的实施方案中，所述裂解液的制备方法包括：将异硫氰酸胍、聚氧乙烯醚brij58与naac
‑
hac缓冲液混合，之后加入水和异丙醇，获得所述裂解液。
23.进一步的，所述naac
‑
hac缓冲液的浓度为50～200mmol/l。
24.进一步的，所述naac
‑
hac缓冲液的ph值为4.0～6.0。
25.进一步的，所述裂解液中异丙醇的体积含量为10～50％。
26.进一步的，所述naac
‑
hac缓冲液、异丙醇与水的体积比为1～10∶1～10∶1～5。
27.在一些较为具体的实施方案中，所述裂解液中异硫氰酸胍的浓度为5.0～6.0mol/l。
28.进一步的，所述裂解液中聚氧乙烯醚brij58的浓度为0.1～1.0mmol/l。
29.在一些较为具体的实施方案中，步骤(2)具体包括：
30.使用洗涤液对步骤(1)所获裂解后的样品进行洗涤处理，之后在磁场作用下进行分离处理；
31.以及，使用乙醇溶液对分离处理所获混合液进行洗涤处理，之后在磁场作用下进行分离处理，获得所述洗涤后的样品。
32.在一些较为具体的实施方案中，所述洗涤液中异硫氰酸胍的浓度为5.0～6.0mol/l。
33.进一步的，所述tris
‑
hcl缓冲液的浓度为0.1～1mol/l。
34.进一步的，所述tris
‑
hcl缓冲液的ph值为4.0～8.0。
35.进一步的，所述乙醇溶液中乙醇的体积含量为50～80％。
36.在一些较为具体的实施方案中，步骤(3)具体包括：将步骤(2)所获洗涤后的样品与洗脱液混合并震荡、离心处理，之后在磁场作用下进行分离，获得所述游离dna。
37.进一步的，所述震荡处理的时间为5～10min。
38.在一些较为具体的实施方案中，所述te缓冲液的ph值为10。
39.进一步的，所述te缓冲液的浓度为40～80mmol/l。
40.进一步的，所述样品包括血浆或血清，且不限于此。
41.在一些更为具体的实施方案中，所述游离dna的提取方法具体包括：
42.(1)取待测样本至离心管，加入裂解液和磁珠，所述待测样本、裂解液与磁珠的体积比为100～200∶150～250∶0.5～3，混匀，尽量避免气泡产生，获得混合液a；
43.(2)将混合液a在转速为1000～3000rpm的条件下离心1～2min后，置于磁力架上静置5～10min，直至溶液澄清，吸除上清液；
44.(3)将步骤(2)处理后的样本从磁力架上取下，加入1～10ml的洗涤液混匀，尽量避免气泡产生，获得混合液b；
45.(4)将混合液b置于磁力架上静置至溶液澄清，吸除上清液；
46.(5)将步骤(4)处理后的样本从磁力架上取下，加入1～10ml的50％～80％乙醇混匀，获得混合物c；
47.(6)将混合液c置于磁力架上静置至溶液澄清，吸除上清液，打开离心管盖，将磁珠风干；
48.(7)将步骤(6)处理后的样本从磁力架上取下，加入10～50μl的洗脱液混匀，获得混合物d；
49.(8)将混合物d充分震荡5～10min，离心后置于磁力架上静置至溶液澄清，将上清液移至新的离心管中，获得游离dna。
50.作为优选，步骤(1)中所述裂解液的制备方法包括：在异硫氰酸胍和聚氧乙烯醚brij58中加入1～5ml浓度为50～200mmol/l的naac
‑
hac(ph值为4.0～6.0)，加去离子水到10ml，再加入10％～50％的异丙醇，即得；其中异硫氰酸胍的浓度为5.0～6.0mol/l，聚氧乙烯醚brij58的浓度为0.1～1mmol/l。
51.作为优选，步骤(3)中所述洗涤液的制备方法包括：将5.0～6.0mol/l异硫氰酸胍溶于0.1～1.0mol/ltris
‑
hcl(ph值为5.0～8.0)即得。
52.作为优选，步骤(7)中所述洗脱液的制备方法包括：40～80mmol/l的te缓冲液(ph值为10)。
53.下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
54.下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
55.实施例1
56.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.5mmol/l聚氧乙烯醚brij58、100mmol/lph值为5.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的40mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产
生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
57.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.1mol/l ph值为6.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
58.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml80％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
59.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(50mmol/lph值为10.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。
60.本实施例中游离dna的分子量测定的结果图如图1所示，本实施例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
61.实施例2
62.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：5.5mol/l异硫氰酸胍、1.0mmol/l聚氧乙烯醚brij58、200mmol/l ph值为4.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的100mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
63.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：6.0mol/l异硫氰酸胍、1.0mol/lph值为8.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
64.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml60％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
65.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(80mmol/l ph值为10.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。本实施例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
66.实施例3
67.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：5.5mol/l异硫氰酸胍、0.1mmol/l聚氧乙烯醚brij58、100mmol/l ph值为5.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的40mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
68.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：5.5mol/l异硫氰酸胍、1.0mol/lph值为6.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
69.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml 80％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
70.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(50mmol/lph值为10.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。本实施例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
71.实施例4
72.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：6.0mol/l异硫氰酸胍、1.0mmol/l聚氧乙烯醚brij58、100mmol/l ph值为6.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的40mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
73.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：6.0mol/l异硫氰酸胍、0.1mol/l ph值为6.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
74.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml 80％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
75.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(80mmol/l ph值为10.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。本实施例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
76.对比例1
77.方法同实施例1，不同之处在于：使用的洗脱液的ph值为9；
78.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.5mmol/l聚氧乙烯醚brij58、100mmol/l ph值为5.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的40mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
79.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.1mol/l ph值为6.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
80.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml80％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
81.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(50mmol/lph值为9.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。本对比例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
82.对比例2
83.方法同实施例1，不同之处在于：使用的洗脱液的ph值为11；
84.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.5mmol/l聚氧乙烯醚brij58、100mmol/l ph值为5.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的40mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
85.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.1mol/l ph值为6.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
86.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml80％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
87.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(50mmol/lph值为11.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。本对比例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
88.对比例3
89.方法同实施例1，不同之处在于：将裂解液中缺少聚氧乙烯醚brij5；
90.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、100mmol/l ph值为5.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的40mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
91.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.1mol/l ph值为6.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
92.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml80％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
93.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(50mmol/lph值为10.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。本对比例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
94.对比例4
95.方法同实施例1，不同之处在于：将裂解液中聚氧乙烯醚brij5替换为sds。
96.(1)取2ml血浆放入10/15ml离心管中，加入2.5ml裂解液(其中裂解液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.5mmol/lsds、100mmol/lph值为5.0的naac
‑
hac缓冲液、4ml异丙醇及水)和30μl混合均匀的40mg/ml磁珠，室温下混匀10min，尽量避免气泡的产生；然后于1000rpm离心1～2min；接着在磁力架上放置5min或至溶液澄清后，吸除澄清液。
97.(2)将离心管从磁力架上取下，加入1ml洗涤液(其中洗涤液包括：5.0mol/l异硫氰酸胍、0.1mol/l ph值为6.0的tris
‑
hcl缓冲液)，用移液枪来回吸取10次混匀，尽量避免气泡的产生；然后转移至新的1.5ml离心管，磁力架上静置2min或至溶液澄清，吸除澄清液；重复一次。
98.(3)将离心管从磁力架上取下，加入1ml 80％乙醇，震荡30s后离心，将离心管放置磁力架上2min或至溶液澄清后，吸除澄清液，重复一次；打开离心管盖，将磁珠风干2～5min。
99.(4)从磁力架上取下离心管，加入15μl洗脱液(50mmol/lph值为10.0的te缓冲液)，震荡5min后简单离心，再将离心管放置磁力架上2min或至液体澄清，然后吸取澄清液至新的1.5ml离心管，得游离dna。本对比例中游离dna浓度测定结果如表1所示。
100.表1实施例1
‑
4以及对比例1
‑
4中游离dna浓度测定结果
101.名称浓度(ng/μl)实施例13.35实施例23.05实施例33.17实施例43.29对比例12.16对比例21.99对比例31.11对比例41.02
102.此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
103.应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。