一种抗炎多肽BMP14及其制备方法和应用与流程

一种抗炎多肽bmp14及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及多肽及其应用技术领域，具体而言，涉及一种抗炎多肽bmp14及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤发炎，大多有发痛、发痒、发红现象；也可因严重程度而呈现水泡，干燥，脱皮等。常见的皮肤感染是金黄色葡萄球菌感染，临床上表现为皮肤疖痈、坏疽、蜂窝组织炎、毛囊炎等。
3.皮肤微生物是皮肤微生态系统的重要成员，皮肤表面的菌群通常可分为常驻菌和暂驻菌。常驻菌是一群在健康皮肤上定居的微生物，包括葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌、不动杆菌、马拉色菌、微球菌、肠杆菌及克雷伯杆菌等。皮肤常驻菌与皮肤健康密切相关。常驻菌可以通过调控皮肤角质形成细胞表达抗菌肽来抵御外界病原菌在皮肤表面的生长。
4.抗菌肽是动物免疫系统中的重要组成部分。在适当抑菌浓度下，抗菌肽能够与生物膜/壁组成成分或胞内细胞器等多种微生物靶位相互作用，前者破坏细胞质膜的完整性，后者干扰细胞的正常代谢活动，最终导致细菌死亡。在一定生理条件下，抗菌肽在先天性免疫细胞中存在与炎症反应、先天性免疫和适应性免疫相关的活性。现有抗菌肽虽然有生物学活性，但也存在溶血、细胞毒性等副作用，体内稳定性差等缺陷，很难实现临床运用。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种抗炎多肽bmp14，其抗菌、抗炎效果好，稳定性好；
6.本发明的第二个目的在于提供一种抗炎多肽bmp14的制备方法，制备得到的产品具有上述优点；
7.本发明的第三个目的在于提供上述抗炎多肽bmp14在多个领域的应用。
8.本发明通过以下技术方案实现：
9.一种抗炎多肽bmp14，其氨基酸序列为ile
‑
asn
‑
leu
‑
arg
‑
val
‑
ile
‑
ala
‑
cys
‑
leu
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val
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lys
‑
ile
‑
leu。
10.本发明提供的抗炎多肽bmp14能够作用于细菌的细胞膜，使得细胞裂解，实现抗菌的效果；还能够影响肥大细胞脱颗粒，实现抗炎作用。
11.具体的，bmp14抑制白细胞中花生四烯酸转变为前列腺素e2(pg e2)，实现其抗炎效应。在高浓度时，bmp14分子占据了由抗原交叉连接起来的2个ige分子的铰链区，导致其构型改变，引起ige
‑
fc受体复合物的正常构型发生改变，从而抑制肥大细胞的活动。
12.进一步地，分子量为1624.0da，等电点为10.86。
13.一种抗炎多肽bmp14的制备方法，根据序列ile
‑
asn
‑
leu
‑
arg
‑
val
‑
ile
‑
ala
‑
cys
‑
leu
‑
val
‑
arg
‑
lys
‑
ile
‑
leu使用固相合成法合成粗多肽。
14.进一步地，还包括将粗多肽通过hplc反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽
的纯度不低于95％。
15.进一步地，还包括测定纯化后的多肽的分子量和等电点。
16.进一步地，hplc纯化的方法为：将粗多肽溶于含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，流动相a为0.1％三氟醋酸
‑
水，流动相b为0.1％三氟醋酸
‑
乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μl。
17.hplc纯化的色谱柱为硅胶烷基键合相c18柱，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相b在洗脱剂中的含量从0％～80％按线性关系增长，流速1ml/min，检测波长215nm，25℃下测定。
18.进一步地，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi
‑
tof)测定其分子量为1624.0da，具体方法为：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/ml的溶液，取10μl与等体积的饱和基质溶液(将α
‑
氰基
‑4‑
羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。
19.进一步地，通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为10.86，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为ile
‑
asn
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leu
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arg
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val
‑
ile
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ala
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cys
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leu
‑
val
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arg
‑
lys
‑
ile
‑
leu。
20.上述抗炎多肽bmp14或者上述抗炎多肽bmp14的制备方法制备得到的产品在化妆品制备领域的应用。
21.具体的，以本发明的抗炎多肽bmp14为原料，通过添加化妆品辅料及其他原料的方式来生产化妆品，常用的辅料有：生理盐水、纯水、甘露醇、多元醇、甘油、羊毛脂、矿物油、植物油等。与该方式使用常用的其他化妆品原料组合有：其他蛋白、其他多肽、植物提取物、细胞因子、维生素等。具体的，选择辅料和化妆品原料中的一种或多种搭配使用。
22.上述抗炎多肽bmp14或者上述抗炎多肽bmp14的制备方法在制备治疗皮肤炎症的药品领域的应用。
23.上述抗炎多肽bmp14或者上述抗炎多肽bmp14的制备方法在调节皮肤微生物、抗氧化护肤品的开发领域的应用。
24.本发明的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
25.(1)本发明提供了一种抗炎多肽bmp14，具有较强的抗菌、抗炎、抗氧化等功能；
26.(2)本发明提供了一种抗炎多肽bmp14，稳定性好，副作用低；
27.(3)本发明提供了一种抗炎多肽bmp14的制备方法，使用固相合成多肽，成本较低，质量可控性高；
28.(4)本发明提供了一种抗炎多肽bmp14可以在制备化妆品、制备治疗皮肤炎症的药品、护肤品开发领域应用。
附图说明
29.图1为bmp14的溶血活性测定结果；
30.图2为bmp14的细胞毒活性测定结果；
31.图3为bmp14的血浆稳定性测试结果；
32.图4为bmp14减少ros的生成的测试结果；
33.图5为bmp14对炎症因子的影响测试结果。
具体实施方式
34.实施例1
35.(1)根据设计的氨基酸序列：
36.ile
‑
asn
‑
leu
‑
arg
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val
‑
ile
‑
ala
‑
cys
‑
leu
‑
val
‑
arg
‑
lys
‑
ile
‑
leu，用固相合成法合成得到粗多肽；
37.(2)将粗多肽通过hplc反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；
38.hplc纯化及鉴定方法：
39.将0.1mg待测样品溶于1ml含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相a为0.1％三氟醋酸
‑
水，流动相b为0.1％三氟醋酸
‑
乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μl；色谱柱为硅胶烷基键合相c18柱(4.6mm
×
300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100a)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相b在洗脱剂中的含量从0％
‑
80％按线性关系增长，流速1ml/min，检测波长215nm，25℃下测定。
40.(3)通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi
‑
tof)测定其分子量为1624.0da；
41.方法：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/ml的溶液，取10μl与等体积的饱和基质溶液(将α
‑
氰基
‑4‑
羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。
42.(4)通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为10.86，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为ile
‑
asn
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leu
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arg
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val
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ile
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ala
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cys
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leu
‑
val
‑
arg
‑
lys
‑
ile
‑
leu。
43.实验例1
44.抗菌活性检测
45.最小抑菌浓度即能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。实验采用二倍梯度稀释的方法，具体实验操作如下：准备好新鲜菌液，使用紫外分光光度计检测菌液的od600，按照1od600＝1
×
109cfu/ml，用新鲜lb液体培养基将上述菌液浓度稀释调整至2
×
105cfu/ml。之后预先在无菌的96孔板中加入100μl生理盐水，在第一孔内加入待测样品，依次对待测样品进行二倍梯度稀释，再在每孔内加入100μl浓度为2
×
105cfu/ml的菌液，用移液枪将其吹打混匀，混匀后置于37℃恒温培养箱中过夜培养，最后用酶标仪检测菌液在600nm处的光吸收值，以检测不到细菌生长的孔和相邻孔的样品浓度的平均值作为最小抑菌浓度，即mic值。多肽bmp14的抑菌活性见表1。
46.表1：多肽bmp14对标准菌株的最小抑菌浓度
47.48.由表1，多肽bmp14对金黄色葡萄球菌标准菌株(staphylococcus aureus atcc2592)以及大肠杆菌标准菌株(escherichia coli atcc25922)的最小抑菌浓度均为分别是4.34μg/ml和8.76μg/ml。
49.以上实验结果说明，本发明提供的多肽bmp14具有良好的抗菌效果。
50.实验例2
51.溶血活性和细胞毒性检测
52.用生理盐水把洗涤好的红细胞的密度稀释调整为107
‑
108个/ml，同时将待测样品配制成不同的梯度浓度，将二者放置于37℃恒温中共孵育30min，随后1000rpm离心5min，用酶标仪检测上清液540nm的光吸收值。该实验中生理盐水作为阴性对照，相同体积的tritonx
‑
100(10％)作为阳性对照，溶血活性则与540nm处的光吸收值成正比。
53.溶血活性如附图1所示，bmp14溶血活性较低。
54.使用人胚肾细胞株hek293t进行细胞毒性测定。待细胞生长状态良好且密度长至瓶底的80％时，弃去培养基，用无菌的pbs洗涤3次，随后用胰酶对贴壁细胞进行消化，终止后加入新鲜的含10％fbs的dmem培养基吹吸混匀，并将细胞悬液浓度调整至5
×
105个/ml，实验采用无菌96孔板，在各孔内加入上述细胞悬液200μl，放入细胞培养箱中过夜培养。次日，加入不同浓度的待测样品，浓度梯度设置为80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、0μg/ml，每个浓度3个重复，对照组使用相同体积的无菌pbs，随后放入37℃、5％co2的恒温培养箱中继续培养24小时。在每个孔内加入5mg/ml的mtt溶液10μl，在避光条件下放入培养箱中继续培养4小时。最后，小心吸取并弃去孔中液体，加入dmso(dimethyl sulfoxide)100μl，将96孔板放在摇床上缓慢摇晃10分钟待结晶溶解，用酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。
55.测试结果如附图2所示，结果说明本发明提供的抗炎多肽bmp14的细胞增殖能力高，无细胞毒性。
56.实验例3
57.稳定性测试
58.用无菌注射器获取10ml人体血液储存于抗凝管中，在4℃、3500rpm的条件下离心30min，小心吸取黄色上清，即为所需血浆。用无菌生理盐水将上述血浆稀释一倍，并将多肽bmp14加入其中，控制bmp14的终浓度为10mg/ml。随后，把溶有多肽bmp14的血浆放入37℃的恒温培养箱中进行孵育，分别在0、0.5、1、2、4、6、8、10小时等8个时间点各取10μl，用抑菌圈法检测多肽bmp14与血浆共孵育后其对鲍曼不动杆菌的抗菌活性，每个时间点设置两个重复。
59.测试结果如附图3所示，bmp与血清孵育10小时，仍然可以检测到抗菌活性，说明本发明提供的bmp14稳定性好。
60.实验例4
61.对ros的影响
62.对数生长期状态良好的raw264.7细胞(2x105个/ml)铺在96孔细胞板上，每孔100ul，40ml/l的dmem维持培养液培养过夜。弃去上清，空白组加入维持培养基，药物处理组先加入含80、40、20ug/ml的bmp14维持培养基与细胞孵育1h后加入含lps终浓度为1ug/ml的维持培养基，培养48h后弃去上清。将ros检测探针dcfh
‑
da加入到稀释好的细胞中，终浓度
10um，37℃孵育15min，400xg洗涤细胞，去除多余探针；流式细胞仪使用488nm激发波长，525nm发射波长检测ros阳性细胞比例。
63.由附图4可见，随着bmp14的剂量的增大，可显著抑制lps诱导的ros生成。ros阳性(dcf阳性)细胞抑制率200ug/ml组抑制率为23％，400ug/ml组抑制率为39％，800ug/ml组抑制率为62％。
64.实验例5
65.对炎症的影响
66.按照不同细胞因子elisa试剂盒使用说明，检测bmp14对细胞因子的影响。用elisa试剂盒分别检测培养基上清中tnf
‑
α，il
‑
6，il
‑
10，il
‑
1β，ifn
‑
γ的含量。具体过程如下：将包被抗体用包被液稀释至浓度为0.5和2.0μg/ml，分别加入取96孔elisa板，100μl/孔，重复3个孔，4℃下包被过夜。次日取出后用洗涤液pbst洗涤三次，每次持续5分钟。后用200μl封闭液2％bsa37℃下封闭1h后，洗涤同前。将保存于
‑
20℃用于检测的细胞上清加入elisa板上，50μl/孔，48r和72h培养上清分别对应包被孔，加入50μl洗涤液至每孔，于37℃湿盒中放置2h，取出后洗涤同前。接着每孔中对应加入100μl按说明书稀释至工作浓度(1μg/ml)的生物素偶联的抗体，于37℃湿盒中放置2h，取出后洗涤同前。接着每孔中抗生物素的辣根过氧化物酶标二抗(1：1000倍稀释)100μl，于37℃湿盒中作用1h，随后洗涤同前。继而向每孔中加入100μl显色液(opd)，于37℃作用15min，最后加入50μl终止液(2mh2so4)终止反应。在酶标仪上检测od值。
67.附图5显示，bmp14对lps刺激的tnf
‑
α，il
‑
6，il
‑
10，il
‑
1β分泌均有明显抑制作用；但bmp14不会刺激细胞产生tnf
‑
α，il
‑
6，il
‑
10，il
‑
1β，ifn
‑
γ。浓度约为500μg/ml时可抑制大部分细胞因子的分泌，说明本发明的bmp14具有良好的抑制炎症效果。
68.实验例6
69.bmp14的自由基清除活性(dpph radical scavenging assay)
70.dpph(2,2
‑
diphenyl
‑1‑
picrylhydrazylhydrate)(2,2
′‑
二苯代苦味酰基苯肼)，是一种稳定的以氮为中心的脂性自由基，其结构中含有3个苯环，其甲醇或乙醇溶液呈紫色，在517nm附近有强吸收，当有供氢能力的抗氧化剂存在时，颜色会由深紫色变为浅黄色，在517nm处的吸光度变小。其吸光度变小的程度与清除自由基的能力呈正相关性，因而可用于检测抗氧化活性。称取一定量的dpph(sigma，美国)，用甲醇溶解，配成6
×
10
‑
5m的溶液，现配现用。将48μldpph溶液和2μl样品(2mg/ml)混合(最终样品与dpph的质量比为3:1)，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。dpph
·
清除率(％)＝(ab－aa)/ab
×
100(ab:absorbanceofblank；aa:absorbanceofsample)。在样品浓度为60μg/ml时，bmp
‑
14对dpph自由基的清除率为48.2
±
4.6％，说明bmp
‑
14具有较好的自由基清除能力。
71.实验例6
72.bmp
‑
14对肥大细胞(mast cell)脱颗粒的影响
73.wistar大鼠断颈处死，腹腔内注射10ml台氏液(tyrode’ssolution,137mmnacl,2.7mmkcl,1.36mmcacl2,0.49mmmgcl2,0.36mmnah2po4,11.9mmnah2co3,and5.04mmd
‑
glucose)，轻轻腹部按摩10min，打开腹腔吸出台氏液(含有肥大细胞)，1000rpm离心5min，重复用台氏液洗一次，再用1
‑
2ml台氏液悬浮肥大细胞。取10μl样品和90μl细胞悬液在37℃
孵育15min，然后3000rpm离心5min。吸取50μl上清，加入50μl底物(3mg的ρ
‑
nitrophenyl
‑
n
‑
acetyl
‑
β
‑
d
‑
glucosaminidine溶于10ml200mm，ph4.5的醋酸钠缓冲液)继续孵育6h后加入100μlph10.0的na2co3终止反应，于405nm波长测光吸收。阴性对照为样品溶解介质，阳性对照为0.1％(v/v)的tritonx
‑
100。本试验重复3次。肥大细胞脱粒率按下列公式计算：肥大细胞脱粒率％＝[(样品组肥大细胞脱粒量－阴性对照组肥大细胞脱粒量)/阳性对照组肥大细胞脱粒量]
×
100％。cathelicidin
‑
bf的肥大细胞脱颗粒活性，结果表明bmp
‑
14在浓度为50μg/ml时其肥大细胞脱粒率为42.5％。bmp
‑
14具有的较强的抑制肥大细胞脱颗粒活性表明其可影响免疫反应，可在炎症反应中起到作用。
[0074]
实验例8
[0075]
bmp14对大鼠皮肤炎症的影响
[0076]
将40只sd大鼠在动物造模前1天，用脱毛膏对背部进行脱毛，区域为3cm
×
3cm，脱毛后1天在脱毛区域涂50 l5％2，4－二硝基氯苯(dncb)第1次致敏实验；在8天后，在脱毛区二次脱毛，二次脱毛第2天，在脱毛区域外涂100l1％dncb第2次致敏。后3周，每周100l1％dncb致敏1次，连续4周。最后一次致敏完成后3天，造模结束，大鼠皮肤表面表现为角化、片状红斑、结痂、表皮突延长、棘层肥厚、轻度海绵水肿等症状，这提示着造模成功。选取造模成功的sd大鼠30只按照数字随机表法随机分为模型组(生理盐水)、阳性对照组(0.1％丁酸氢化可的松乳膏,剂量:1.0g/kg)和实验组(剂量:80g/只耳)，每组各10只大鼠，经皮给药5周。急性炎症:对sd大鼠耳部涂抹药物，连续用药5周，在用药5周后，在右耳部涂抹20 l5％dncb急性致敏实验。疗效评估症状评分：分析大鼠皮肤苔藓化、红斑以及丘疹程度，并对症状分级严重程度实施评分。苔藓化:0分无苔藓化，1分少量细小鳞屑，2分明显细薄鳞屑，3分大量鳞屑。红斑:0分无红斑，分隐约可见微红红斑，2分出现明显淡红红斑，3出现大量暗红红斑。丘疹:0分无丘疹，1分丘疹散在，2分丘疹相互融合、密集，3分丘疹融合明显、很密集。在治疗前，三组大鼠苔藓化、红斑、丘疹症状积分差异不显著(p＞0.05)；在治疗后，阳性对照组、实验组苔藓化、红斑、丘疹症状积分均显著的低于模型组(p＜0.05)，见表2。
[0077]
表2 bmp14对大鼠皮肤炎症模型的治疗作用
[0078][0079][0080]
注:*p＜0.05，与模型组治疗后相比差异显著；#p＜0.05，与治疗前相比差异显著。
[0081]
上述结果说明，本发明设计的全新多肽bmp14可直接杀灭病原菌，可以通过减少ros、影响肥大细胞脱颗粒等途径调控炎症因子，减轻炎症反应。功能显著，作用途径丰富。bmp14溶血活性低、无细胞毒性，且稳定性较高，可以运用于皮肤炎症治疗的药物或者护肤品。
[0082]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人
员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。