多重PCR芯片及利用其的多重PCR方法与流程

多重pcr芯片及利用其的多重pcr方法
技术领域
1.本发明涉及一种能够同时检测多个靶基因的多重pcr芯片及利用其的多重pcr方法。


背景技术：

2.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；pcr)是一种通过反复加热和冷却包括核酸分子的样品溶液以链状地复制并几何级数地扩增具有特定核苷酸序列的部位(靶核酸)的技术，是一项能够通过扩增、复制微量的核酸来检测靶基因的技术。
3.这样的pcr方法反复执行dna变性步骤、退火步骤以及dna合成步骤，dna变性步骤(denaturing step)是将含有双链模板dna的样品溶液在特定温度下，例如在约95℃下加热5秒以将双链dna分离成单链dna的步骤；退火步骤(annealing step)是在dna变性步骤之后将与要扩增的规定核苷酸序列具有相辅的序列的引物注入样品溶液，并将其与单链dna一起在特定温度下，例如在50℃下维持5秒以使引物与单链dna的规定核苷酸序列杂交以形成部分dna-引物复合体的步骤；dna合成步骤(extension step)是在退火步骤之后将将样品溶液在dna聚合酶的活性温度下，例如在72℃下维持5秒以通过dna聚合酶polymerase)基于部分dna-引物复合体的引物来形成双链dna的步骤。另外，可以通过检测由与靶核酸结合的荧光染料生成的荧光来检测靶核酸。
4.为了适当地执行这样的pcr方法，除了试药(引物和荧光染料)和试料(样品溶液)外，还需要具备一个或多个反应室的pcr芯片、以及加热和冷却所述pcr芯片以诱导扩增反应并测量其结果的pcr装置。尤其，在便携式实时pcr装置中，会使用较小而扁平的形态的微型pcr芯片。微型pcr芯片具备一个或多个能够在透明基板中容纳试药和试料的反应室。另外，在所述pcr装置中具备用于拍摄由与靶核酸结合的荧光染料产生的荧光的摄像头。
5.另一方面，通过一次实验检测多个靶基因被称为同时多重检测，即多重(multiplex)pcr。为了这样的多重pcr，需要使用多种多样的荧光染料，需要能够区分由多个引物构成的引物组和多种荧光染料并防止荧光染料之间的干涉的复杂的探针的设计。这是因为对应于种种荧光色的激发和发射波长带重叠。
6.为了解决这样的化学多重方式问题，近来在开发一种在空间上孤立化的系统。即，如专利文献中所公开，以往的多重pcr芯片将多个探针固着于一个反应室内，并诱导固定在所述反应室的探针粒子与试料之间的反应，以便能够一次扩增并检测多个靶核酸。
7.即，使彼此不同的种类的探针固着于反应室上的彼此不同位置以使探针在空间上分离，并将与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的引物注入在空间上分离的探针，从而能够通过基于探针的位置分析由探针发出的荧光色来同时多重检测。这不但可以减小光学装备的大小，降低转装备价格，而且还可以提高效率，如可以缩短检测所需的时间等。
8.然而，以往的多重pcr芯片中存在的问题是，当使在空间上分离的探针固着于反应室上时，即，当滴下几滴包括引物的液体状态的探针使其固着时，探针滴扩散而难以形成像样的探针粒子。此外，还存在当形成探针粒子时探针粒子容易掉落的问题。此外，还存在因
仅凭探针的位置获得多样的组合存在局限性而限制可检测的靶基因的数量的问题，并且还存在由于当pcr芯片的左右发生变化使会致使探针的位置发生变化，因而难以局限同时多重检测的问题。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.韩国授权专利第10-1724281号授权(授权日：2017年04月03日)。


技术实现要素：

12.技术问题
13.本发明旨在解决这样的问题，本发明的首要目的在于，提供一种能够一次同时扩增并检测多个靶核酸的多重pcr芯片。
14.本发明的另一目的在于，提供一种能够使与彼此不同的核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立，并基于这些探针粒子的位置来进行同时多重检测的多重pcr芯片。
15.本发明的又一目的在于，提供一种在pcr芯片的反应室的内部形成在空间上分离的探针粒子，且在反应室的内部形成容纳预定量的探针的粒子形成槽，以便能够容易制作所述探针粒子的大小和形态的pcr芯片。
16.此外，本发明的又一目的在于，提供一种通过在用于形成探针粒子的粒子形成槽的底部和内侧面形成由凸出预定长度的多个突起构成的粒子固定体，以防止固定于所述粒子形成槽的探针粒子容易分离的方式进行固定的pcr芯片。
17.此外，本发明的又一目的在于，提供一种通过在使与核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立的同时，使探针粒子的大小、形态或图案不同或使粒子固定体的形态或图案彼此不同，能够基于探针粒子的位置以及其形态和图案对多种多样的靶核酸进行同时多重检测的多重pcr芯片。
18.此外，本发明的另一目的在于，提供一种用一个连接通道连接多个反应室，并在固定于所述多个反应室的探针粒子的表面涂布防水涂层剂，以便在将试料注入pcr芯片时能够通过一次的试料的注入将试料填充到所有反应室，从而使同时多重检测容易的多重pcr芯片。
19.同时，本发明提供一种利用上述多重pcr芯片的多重pcr方法。
20.技术方案
21.作为用于达成本发明的目的的方案，本发明的多重pcr芯片包括：基板，其由透明的材料制成；一个或多个反应室，其以预定的大小和深度形成于所述基板上；以及多个粒子形成槽，其以能够容纳预定量的液体状态的探针的大小和深度形成于所述反应室的内部，并且注入在空间上分离的彼此不同的粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物、与所述引物结合的荧光染料以及使所述引物固着的支撑体。
22.作为本发明的另一实施例，本发明的多重pcr芯片包括：基板，其由透明的材料制成；一个或多个反应室，其以预定的大小和深度形成于所述基板上；以及多个粒子形成槽，其以能够容纳预定量的液体状态的探针的大小和深度形成于所述反应室的内部，并且所述
粒子形成槽呈多种平面形状，注入于呈彼此不同的平面形状的粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物、与所述引物结合的荧光染料以及使所述引物固着的支撑体。
23.在本发明中，所述探针中包括的支撑体通过物理刺激(光、温度、超声波)来形成三维的网络结构体以形成对应于所述粒子形成槽的形态的探针粒子。
24.在所述粒子形成槽的内部形成有用于防止所述探针粒子脱离的粒子固定体。
25.所述粒子固定体由从所述粒子形成槽的底部或内侧面凸出预定长度地形成的多个突起构成并与所述探针粒子一体地结合。
26.所述粒子固定体形成为彼此不同的形态或图案，形成于在空间上分离的所述粒子形成槽的粒子固定体具有彼此不同的形态或图案，并且注入于所述粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物。
27.形成于所述基板上的反应室的数量为多个，所述多个的反应室通过一个连接通道串联连接，在所述连接通道的一端形成有用于注入试料的注入口，在另一端形成有排出试料的排出口，以使通过所述注入口注入的试料被供应并填充到所有反应室。
28.本发明的多重pcr方法包括：制备多个反应室通过一个连接通道串联连接并且在每个反应室的内部形成有在空间上分离的多个粒子形成槽的pcr芯片的pcr芯片制备步骤(s110)；将具备与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的引物、与所述引物结合的荧光染料以及固化时形成三维网状结构的支撑体的溶液状态的探针注入所述多个粒子形成槽的探针注入步骤(s120)；在对注入于所述粒子形成槽的探针施加物理刺激以使所述支撑体固化的同时使引物固着于所述支撑体的内部以形成对应于所述粒子形成槽的形态的探针粒子的探针粒子固定步骤(s130)；以及将清洗液注入固定有所述探针粒子的多个反应室以在所述支撑体上形成多孔的探针粒子清洗步骤(s140)。
29.为了对所述多个反应室和连接通道的开放部进行密封而在所述pcr芯片的一面贴附密封膜，并为了对所述注入口和排出口的开口部进行密封而贴附贴纸的密封步骤(s150)；通过所述注入口将试料注入并填充到多个反应室的试料注入步骤(s160)；在通过反复加热和冷却所述pcr芯片以使试料中包括的规定核苷酸序列和引物杂交来链状复制并扩增靶核酸后，以贯通所述多个反应室的方式照射激发光，并基于由与所述引物结合的荧光染料发出的荧光色和所述探针粒子的位置及形态一次检测多个靶基因的pcr步骤(s170)。
30.在形成于所述基板的多个粒子形成槽的内侧面具备粒子固定体，该粒子固定体由能够固定形成于所述粒子形成槽的内部的所述探针粒子的方式凸出预定长度地形成的多个突起构成。
31.所述粒子固定体形成为彼此不同的形态或图案，形成于在空间上分离的粒子形成槽的粒子固定体具有彼此不同的形态或图案，并且注入于所述粒子形成槽的所述探针包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的彼此不同的种类的引物。
32.发明的效果
33.根据本发明，具有能够一次同时扩增并检测多个靶核酸的效果。
34.本发明具有使与彼此不同的核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立，并且能够基于这些探针粒子的位置来进行同时多重检测的效果。
35.本发明具有通过在反应室的内部形成容纳预定量的探针的粒子形成槽，容易制作所述探针粒子的大小和形态，并且能够基于在空间上分离的探针粒子的位置和形态进行同时多重检测的效果。
36.本发明具有通过在用于形成探针粒子的粒子形成槽的底部和内侧面形成由凸出预定长度的多个突起构成的粒子固定体，以防止固定于所述粒子形成槽的探针粒子容易分离的方式进行固定的效果。
37.本发明具有通过在使与核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立的同时，使探针粒子的大小、形态或图案不同或使粒子固定体的形态或图案彼此不同，能够基于探针粒子的位置以及其形态和图案对多种多样的靶核酸进行同时多重检测的效果。
38.本发明具有用一个连接通道连接多个反应室，并在固定于所述多个反应室的探针粒子的表面涂布防水涂层剂，以便在将试料注入pcr芯片时能够通过一次的试料的注入将试料填充到所有反应室，从而使同时多重检测容易的效果。
附图说明
39.图1是示出本发明的多重pcr芯片的一例的示意性的平面图。
40.图2是图1所示的多重pcr芯片的示意性的剖视图。
41.图3a至图3d是示出本发明的多重pcr芯片的多样的实施例的平面图。
42.图4是示出本发明的多重pcr装置的一例的示意性的剖视图。
43.图5是示出本发明的多重pcr芯片的另一实施例的示意性的平面图。
44.图6是示出本发明的多重pcr芯片的另一实施例的示意性的平面图。
45.图7是示出利用图6所示的多重pcr芯片的多重pcr方法的剖视流程图。
46.附图标记
47.1：多重pcr芯片，2：探针粒子，3：基板，4：密封膜，5：反应室，6：注入口，7：粒子形成槽，9：粒子固定体，10：pcr装置，11：加热块，13：光源部，15：摄像头，21：连接通道，21a：弯曲部。
具体实施方式
48.对于本发明的优点和特征以及达成其的方法，将通过结合附图详细后述的实施例进行详细说明。但是，本发明不限于这里描述的实施例，而是也可以以别的形态被具体化。需要指出的是，本实施例是为了以使本发明所属领域的普通技术人员足以能够容易地实施本发明的技术思想的程度进行详细说明而提供的。此外，在描述本发明的实施例时，当判断为对相关公知构造或功能的具体的说明妨碍对本发明的实施例的理解时，省略其详细的说明。
49.首先，图1是示出本发明的多重pcr芯片的一例的平面图，图2是图1所示的多重pcr芯片的剖视图。图如1和图2所示，在本发明的多重pcr芯片1(下称“pcr芯片”)中，在使与试料内的核酸分子特异性杂交的多个探针粒子2在空间上分离的同时，将探针粒子2的形态形成得彼此不同，以便基于探针粒子2的位置和形态容易地进行同时多重检测。
50.为此，本发明的多重pcr芯片1包括由透明的塑料材料制成的基板3、以预定的大小和深度形成于所述基板3的一面的一个或多个反应室5、以及以预定的大小和深度形成于所
述反应室5的底面的一个或多个粒子形成槽7。
51.另外，在所述粒子形成槽7中注入包括与彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的引物、与所述引物结合的荧光染料以及使所述引物固着的支撑体的探针。因此，当使注入于所述粒子形成槽7的液体状态的探针固化时，以对应于所述粒子形成槽7的形态形成探针粒子2。
52.此时，所述粒子形成槽7可以在空间上分离的同时形成为彼此不同的平面形态。这样，由所述粒子形成槽7形成的探针粒子2也会在空间上孤立的同时具有彼此不同的形态。
53.此外，在所述粒子形成槽7的底部或内侧面形成有粒子固定体9，该粒子固定体9由以能够固定所述探针粒子2的方式以预定长度凸出的多个突起构成。所述粒子固定体9的突起可以形成为多样的形态，所述突起可以以多样的图案配置。因此，由所述粒子形成槽7形成的探针粒子2通过在使所述粒子固定体9一体地结合以防止脱离的同时，使形成于彼此不同的粒子形成槽7的粒子固定体9的形态和图案构成得彼此不同，可以对多种多样的靶基因彼此区分开来进行检测。
54.另一方面，在所述基板3的一侧面以能够向所述反应室5内注入试料的方式形成有注入口6，并在相反侧以能够排出所述反应室5内的试料的方式形成有排出口8。此外，在所述注入口6与排出口8之间形成有连接通道。另外，在所述基板3的下表面贴附有密封膜4。所述密封膜4由薄膜制成，以便在对所述反应室5的开放部进行密封的同时使热迅速被传递至反应室5的内部的试料。此外，所述密封膜4的表面被处理为亲水性，使得试料能够顺畅地移动。另外，还可以具备用于对所述注入口6和排出口8的开口部进行密封的密封贴纸12。
55.如此，本发明的多重pcr芯片1在所述反应室5的内部形成在空间上分离的多个粒子形成槽7并将具有对应于所述粒子形成槽7的形态的探针粒子2形成为在空间上分离的同时，使所述粒子形成槽7的平面形状不同，从而可以容易地区分具有彼此不同的形态的探针粒子2。
56.此外，在本发明中，在所述粒子形成槽7的底部或内侧面形成由凸出预定长度的多个突起构成的粒子固定体9以防止所述探针粒子2容易脱离的同时，将构成所述粒子固定体9的突起的形态和图案形成得不同，以便能够基于所述探针粒子2的位置和/或形态以及所述粒子固定体9的形态和图案来对多种多样的靶基因进行同时多重检测。
57.更具体地，再次参照图1和图2，所述基板3具有预定的厚度，并且一个或多个反应室5以预定的大小和深度形成所述基板3的一部分面上。另外，多个粒子形成槽7隔开预定距离地形成于所述反应室5的底部。因此，所述粒子形成槽在空间上分离。
58.此时，所述粒子形成槽7以能够容纳预定量的探针的大小和深度形成。所述探针包括与试料内的彼此不同的核酸分子的序列特异性杂交的引物、与所述引物结合而发出预定波长的荧光的荧光染料、以及维持液体状态而后固化时在形成三维网状结构时使所述引物固着的支撑体。
59.所述粒子形成槽7形成为多样的形状。例如，所述粒子形成槽7的平面形状由四边形、圆形、五边形等多样的形态构成。当将预定量的探针注入多个粒子形成槽7并使其固化时，以对应于所述粒子形成槽7的形态形成探针粒子2。
60.此外，在所述粒子形成槽7的内侧面一体地形成有由凸出预定长度的多个突起构成的粒子固定体9，以固定所述探针粒子2。例如，所述粒子固定体9可以在注射成型所述基
板3时被一起成型。优选地，所述粒子固定体9使所述粒子形成槽7的表面粗糙或扩大表面积以在形成所述探针粒子2时一体地结合来防止所述探针粒子2分离。
61.另外，构成所述粒子固定体9的突起可以形成为四边形、圆形、棱锥形等多样的形态。另外，形成于所述粒子形成槽7的底部和/或内侧面的突起可以形成为多样的图案。
62.如此，本发明在通过形成粒子形成槽7，使得探针粒子2容易形成的同时，使粒子形成槽7的平面形状不同来形成多样的形态的探针粒子2，使探针粒子2在空间上分离的同时，能够在形态上进行区分，并且通过向彼此不同的粒子形成槽7中注入与彼此不同的核酸分子特异性杂交的彼此不同的种类的引物，能够基于所述探针粒子2的位置以及形态来对多个靶基因进行同时多重检测。
63.此外，本发明通过在反应室5的内部形成在空间上分离的多个粒子形成槽7的同时，在所述粒子形成槽7的内侧面形成由以能够固定所述探针粒子2的方式凸出地形成的多个突起构成的粒子固定体9的形态以牢固地固定所述探针粒子2的同时，根据所述粒子固定体9的形态和图案注入与彼此不同的核酸分子特异性杂交的彼此不同的种类的引物，使得能够基于所述探针粒子2的位置和形态以及形成于探针粒子2的内部的粒子固定体9的形状和图案来对多种多样的靶基因进行同时多重检测。
64.再次参照图1和图2，在所述pcr芯片1的基板3以能够容纳预定量的试料的方式以预定的深度和大小形成有反应室5。另外，在所述反应室5的底部形成有两个粒子形成槽7。此时，两个粒子形成槽7被设置为隔开预定距离，从而在空间上分离。例如，在位于右侧的粒子形成槽7和位于左侧的粒子形成槽7中注入包括与彼此不同的核酸分子特异性杂交的彼此不同的种类的引物的探针来形成探针粒子2。
65.此外，所述粒子形成槽7形成为彼此不同的平面形状。例如，位于左侧的粒子形成槽7形成为圆形的平面形状，位于右侧的粒子形成槽7形成为四边形的平面形状。另外，在呈彼此不同的平面形状的粒子形成槽7中注入包括彼此不同的种类的引物的探针来形成探针粒子2。
66.另一方面，所述探针粒子2中包括的支撑体执行固定引物的同时支撑探针粒子2的作用。优选地，所述支撑体由以能够与引物混合的方式维持液体状态且在注入所述粒子形成槽7之后以能够形成探针粒子2的方式转换为凝胶或固体状态的物质制成。
67.优选地，所述支撑体可以由形成三维的网状体的多孔海绵或水凝胶制成。水凝胶指具有可以含有大量水分的三维的亲水性高分子网状结构的物质。水凝胶的成分包括聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物以及具有丰富亲水基团的共聚物。由于水凝胶的构成要素中的90％以上由水分构成，具有流动性，因而可以混合引物等。这样的水凝胶可根据选定何种高分子作为主链或选定何种交联方式而显现多样的性质，并且也可以通过利用高分子链自身的特性或在高分子链中引入规定官能团来将粘结性引入水凝胶中。
68.另外，水凝胶在受到光、热或超声波等物理刺激时容易固化而变为凝胶形态。即，水凝胶在受到物理刺激时形成三维的网状体。例如，当对pegda pre-plolymer(预聚物)溶液以2秒的间隔多次照射紫外线时，也可以在塑料基板上固定水凝胶固定体。因此，在对水凝胶施加物理刺激的过程中，引物分散并固着于支撑体的内部。
69.因此，当将探针注入所述粒子形成槽7的内部后给予预定的物理刺激时，所述支撑体在形成网状的多孔体时硬化而形成探针粒子2。然后，当用清洗水清洗所述探针粒子2时，
位于多孔体之间的通道的杂质被洗脱时形成多孔性的探针粒子2。从而，在所述探针粒子2形成试料能够通过的许多通道。然后，插入至探针粒子2的通道的试料会与位于所述探针粒子2的规定引物反应。另外，所述探针粒子2中包括的荧光染料与从外部照射的激发光反应而发出规定波长的荧光。
70.此外，由于探针粒子2形成为与粒子形成槽7对应的形状，因而通常可能容易从所述粒子形成槽7脱离。为了解决这样的问题，在所述粒子形成槽7的内侧面，即在底部和内侧面形成由以预定的长度凸出的多个的突起构成的粒子固定体9。这样，多个突起一体地结合于所述探针粒子2的内部，以防止探针粒子2分离。
71.另外，形成于所述粒子形成槽7的粒子固定体9的突起可以形成为圆柱、四角柱、菱形等多样的形态。此外，形成于所述粒子形成槽7的底部和内侧面上的多个突起可以以多种图案排列。
72.如此，粒子固定体9不仅改善与探针粒子2的结合，而且还使得能够在视觉上区分探针粒子2。例如，当拍摄探针粒子2时，可以在视觉上区分结合在探针粒子2的内部的粒子固定体9的形态和图案。从而，可以基于形成在探针粒子2的粒子固定体9的形态和图案来对多种多样的核酸分子进行同时多重检测。
73.接着，图3a至图3d是示出本发明的多种多样的pcr芯片的平面图。
74.如图所示，对于图3a的pcr芯片1而言，在一个反应室5内，6个圆形的粒子形成槽7以预定的间距间隔开地排列成两排。另外，在排列于上端的粒子形成槽7的底部形成有由四边形的突起构成的粒子固定体9，并且在排列于下端的粒子形成槽7的内部形成有由圆形的突起构成的粒子固定体9。因此，通过根据所述粒子形成槽7的位置和粒子固定体9的形态来形成包括彼此不同的引物的探针粒子2，可以进行同时多重检测。
75.接着，对于图3b的pcr芯片1而言，同样地，在一个反应5内，6个四边形的粒子形成槽7以预定的间距间隔开地排列成上下两排，在排列于上端的粒子形成槽7的底部形成有由四边形的突起构成的粒子固定体9，并且在排列于下端的粒子形成槽7的内部形成有由圆形的突起构成的粒子固定体9。因此，通过根据所述粒子形成槽7的位置和粒子固定体9的形态来形成包括彼此不同的引物的探针粒子2，可以进行同时多重检测。
76.接着，对于图3c的pcr芯片1而言，在一个反应室5内，6个圆形的粒子形成槽7以预定的间距间隔开地排列成上下2排，且以在排列于上端的粒子形成槽7的内侧面形成有水平地凸出预定长度的圆形的突起、且在排列于下端的粒子形成槽7的底部形成有垂直地凸出预定长度的圆形的突起的方式形成有粒子固定体9。因此，通过根据所述粒子形成槽7的位置和粒子固定体9的形态及图案来形成包括彼此不同的引物的探针粒子2，可以进行同时多重检测。
77.另外，对于图3d的pcr芯片1而言，在一个反应室5内，6个四边形的粒子形成槽7以预定的间距间隔开地排列成上下2排，且以在排列于上端的粒子形成槽7的内侧面形成有水平地凸出预定长度的三角形的突起、且在排列于下端的粒子形成槽7的底部形成有由垂直地凸出预定长度的圆形的突起的方式形成有粒子固定体9。因此，通过根据所述粒子形成槽7的位置和粒子固定体9的形态及图案来形成包括彼此不同的引物的探针粒子2，可以进行同时多重检测。
78.如此，本发明通过将多个探针粒子2形成为在空间上分离，且使所述探针粒子2的
形态彼此不同，并使形成于所述探针粒子2的内部的粒子固定体9的形态和图案彼此不同，使得能够区分多种核酸序列来进行同时多重检测。
79.接着，图4是示出本发明的多重pcr装置10的优选结构的示意性的剖视图。如图所示，本发明的多重pcr装置10大体上包括加热块11、光源部13以及摄像头15。加热块11以预定的时间间隔对pcr芯片1进行加热和冷却。为此，pcr芯片1被安放为贴紧于所述加热块11的上表面。另外，在pcr芯片1的一侧或两侧侧面设置有光源部13。所述光源部13以贯通形成于所述pcr芯片1的反应室5的方式照射预定波长的激发光。优选地，光源部13可以由多个led构成。另外，所述摄像头15被配置为能够拍摄由多个探针粒子2发出的荧光。即，当对所述探针粒子2照射规定的波长的激发光时，与引物结合着的荧光染料会发生反应而发出规定波长的荧光。因此，当利用摄像头15拍摄由探针粒子2发出的荧光时，可以利用荧光色来区分靶基因。
80.另一方面，图5是示出本发明的多重pcr芯片的另一实施例的平面图。如图所示，所述多重pcr芯片1包括由透光性塑料制成的基板3、形成在所述基板3上的一个反应室5、以预定的间距形成在反应室5的内部的探针粒子2、以及与所述反应室连接的注入口6和排出口8。此时，所述探针粒子2可以由隔开预定间距地形成在所述反应室5的内部的多个粒子形成槽7形成。如此，多个探针粒子2在空间上分离，且包括彼此不同的引物，因而可以检测由各探针粒子2发出的荧光色来一次对多个目标基因进行同时多重检测。
81.接着，图6是示出本发明的多重pcr芯片的另一实施例的平面图。如图所示，所述多重pcr芯片1包括由透光性塑料制成的基板3、形成在所述基板3的多个反应室5、以预定的间距形成在所述反应室5的内部的多个探针粒子2、串联连接所述多个反应室5的一个连接通道21、以及分别形成于所述连接通道21的两端的注入口6和排出口8。此时，所述探针粒子2可以由隔开预定间距地形成在所述反应室5的内部的多个粒子形成槽7形成。此外，可以在所述粒子形成槽7的内侧面一体地形成有由多个突起构成的粒子固定体9。
82.如此，本实施例的多重pcr芯片通过利用一个连接通道21串联连接多个的反应室5，使得通过所述注入口6注入的试料能够被供应并填充到所有反应室5，以能够省略反复的移液，从规使同时多重检测容易。优选地，可以在所述连接通道21以能够在一定程度上抑制相邻的反应室5之间的试料的移动的方式形成多个弯曲部21a。
83.图7是示出利用图6所示的多重pcr芯片的pcr方法的优选实施例的剖视流程图。
84.如图所示，本发明的多重pcr方法包括pcr芯片制备步骤(s110)、探针注入步骤(s120)、探针粒子固定步骤(s130)以及探针粒子清洗步骤(s140)。此外，所述多重pcr方法还包括密封步骤(s150)、试料注入步骤(s160)以及pcr步骤(s170)。此外，可以在所述探针粒子清洗步骤(s140)的后端进一步包括对清洗的探针粒子进行干燥的探针粒子干燥步骤。如此，若对探针粒子进行干燥，则使pcr芯片的保管和移送容易，并且能够防止探针粒子在保管或移送过程中受到污染。
85.具体地，所述pcr芯片制备步骤(s110)是制备pcr芯片1的步骤，该pcr芯片1形成有多个反应室5，在每个反应室5的内部以预定的间距形成有多个粒子形成槽7，通过一个连接通道21串联连接多个反应室5，并且在所述连接通道21的一端形成注入口6，而在另一端制备形成有排出口8。此时，可以使所述粒子形成槽7在空间上分离的同时形成为彼此不同的形态，从而在视觉上能够进行区分，并且在可以在粒子形成槽7的内部一体地形成粒子固定
体9。此外，所述粒子固定体9可以形成为彼此不同的形态或图案。
86.接着，探针注入步骤(s120)在形成于所述pcr芯片1的反应室5的内部的多个粒子形成槽7中注入包括引物、荧光染料以及支撑体探针的步骤。此时，可以在空间上分离的粒子形成槽7中注入与彼此不同的核酸分子特异性杂交的引物。然后，所述荧光染料与由外部照射的激发光反应而发出预定波长的荧光。此外，所述支撑体可以由具有三维的亲水性高分子网状结构的水凝胶制成。所述水凝胶可以形成为液体状态而与引物混合，并且在受到物理刺激时固化而形成多孔结构体。
87.在所述探针粒子固定步骤(s130)中，在对注入于所述粒子形成槽7的探针施加预定的物理刺激以使支撑体变形为三维的网状结构体的同时，使引物固定于网状结构体的内部。例如，当以预定的温度对探针施加热或照射紫外线时，水凝胶形成三维网状体，而引物固着于水凝胶网状体的内部。此时，探针固定成对应于粒子形成槽7的形态而探针粒子2。此外，在形成探针粒子2的过程中，粒子固定体9的突起一体地结合于探针粒子2的内部。
88.接着，在所述探针粒子清洗步骤(s140)中，将清洗水注入多个反应室5中以去夹在探针粒子2的多孔中的杂质，以确保多孔性。因此，所述多孔探针粒子2可以使试料沿多个通道流入而与引物反应。
89.接着，在所述密封步骤(s150)中，在pcr芯片1的一面贴附密封膜以对反应室5和连接通道21的开放部进行密封，并在所述注入口6或排出口8的开口部贴附贴纸以整体上进行密封。以上步骤可以由专家在诸如实验室的室内进行，而之后的步骤可以在能够采集血样的现场进行。
90.所述试料注入步骤(s160)是将试料注入多个反应室5的步骤。此时，在多个反应室5通过连接通道21串联连接，并且在所述连接通道21的一端形成有注入口6，而在另一端形成有排出口8的情况下，当将试料注入所述注入口6时，可以使试料通过所述连接通道21注入多个反应室5，从而可以通过一次移液将试料填充到所有反应室5。此时，由于形成在所述反应室5的探针粒子2由防水涂层剂涂布，因而防止探针粒子2融化或彼此不同的引物移动而混合。
91.最后，所述pcr步骤(s170)是如下步骤，即，反复加热和冷却pcr芯片1并链状地复制、扩增靶核酸分子后，为了检测扩增产物，以贯通pcr芯片1的反应室5的方式照射激发光，并利用摄像头15拍摄所述多个探针粒子2中包括的荧光染料与激发光反应而发出的规定波长的荧光，并分析荧光色，由此一次对多样的靶基因进行同时多重检测。
92.如此，本实施例的多重pcr芯片1具有使与彼此不同的核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立，并且能够基于这些探针粒子的位置来进行同时多重检测的效果。此外，本发明具有通过将容纳预定量的探针的粒子形成槽形成于反应室的内部，容易制作所述探针粒子的大小和形态，并且能够基于在空间上分离的探针粒子的位置和形态来进行同时多重检测的效果。
93.另外，本发明具有通过在用于形成探针粒子的粒子形成槽的底部和内侧面形成由凸出预定长度的多个突起构成而粒子固定体，能够以防止固定于所述粒子形成槽的探针粒子容易分离的方式进行固定的效果。此外，本发明具有通过在使与核酸分子特异性杂交的多个探针粒子在空间上孤立的同时，使探针粒子的大小、形态或图案不同或使粒子固定体的形态或图案彼此不同，可以基于探针粒子的位置以及其形态和图案来对多种多样的靶核
酸进行同时多重检测的效果。
94.在上面的本说明书和附图中公开了本发明的优选实施例，并且，尽管使用了特定的术语，但该术语仅用作用于便于说明本发明的技术内容并促进对发明的理解的一般的含义，而并非旨在限定本发明的范围。此外，本发明不限于上面公开的实施例，而是可以以彼此不同的多样的形态实现。本发名的这些实施例仅仅是为了使本发明的公开完整，并向本发明所属技术领域中的一般的技术人员完整地告知发明的范围而提供的，本发明仅由权利要求书中记载的权利要求的范围定义。