四价流感病毒鸡胚培养工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法与流程

1.本发明涉及流感疫苗技术领域，尤其涉及一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚培养工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.四价流感病毒裂解疫苗基本都是通过鸡胚增殖培养制备。在鸡胚中增殖培养病毒，收获鸡胚尿囊液后，对其进行纯化获得单价原液，混配得到四价流感病毒裂解疫苗。现有技术中，四价流感病毒鸡胚培养工艺主要包括病毒接种、培养、冷胚后，收获尿囊液等步骤。采用现有的四价流感病毒鸡胚培养工艺，可得到基本符合药典要求的四价流感病毒裂解疫苗的单价原液。但是所需时间较长，收获液的血凝滴度和病毒滴度较低、蛋白含量较高，料液不够澄清。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是，提供一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊培养工艺、以大幅缩短生产时间，提高收获液的血凝滴度和病毒滴度；降低蛋白含量、使得料液更加澄清。
4.为解决上述技术问题，本发明公开了以下技术方案：
5.一种四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊培养工艺，包括建库、接种、增殖和冷胚步骤，在所述冷胚步骤之前，还包括有：
6.速冻步骤：在
‑
20
±
5℃条件下，冷冻0.5
‑
1.5小时。
7.作为一些可能的实施方式，所述建库步骤包括：
8.将病毒种子经缓冲液稀释至适宜浓度后，接种9
‑
11日龄spf鸡胚培养，收获尿囊液；其中，所述缓冲液为ph值为8.0、添加了蔗糖的磷酸盐缓冲液，其蔗糖含量以质量计为2％
‑
5％。
9.作为一些可能的实施方式，所述建库步骤具体包括：
10.主种子批建库：原始种子开启，经所述缓冲液稀释至3.0
‑
7.0lg eid
50
/ml浓度后，接种9
‑
11日龄spf鸡胚，在33
‑
35℃条件下，对甲型流感病毒培养48
‑
54小时、对乙型流感病毒培养60
‑
66小时，收获尿囊液。
11.作为一些可能的实施方式，所述建库步骤还包括：
12.工作种子批建库：主种子批经所述缓冲液稀释至3.0
‑
7.0lg eid
50
/ml浓度后，接种9
‑
11日龄spf鸡胚，在33
‑
35℃条件下，对甲型流感病毒培养48
‑
54小时、对乙型流感病毒培养60
‑
66小时，收获尿囊液。
13.作为一些可能的实施方式，在所述建库步骤中，每次收获尿囊液之前，均执行一次所述速冻步骤和冷胚步骤。
14.作为一些可能的实施方式，所述接种步骤具体包括：
15.取工作种子批病毒种子，用缓冲液将工作种子批毒种稀释成5.0
‑
7.0lg eid
50
/ml。
16.作为一些可能的实施方式，所述增殖步骤具体包括：
17.按照每胚0.2
±
0.05ml接种量，在培养温度34
±
1℃、湿度65
±
10％条件下，培养48
‑
72小时。
18.作为一些可能的实施方式，，所述冷胚步骤具体包括：
[0019]2‑
8℃冷胚5
‑
10小时后，收获尿囊液。
[0020]
相应地，本发明还公开了一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，采用如上所述的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊培养工艺。
[0021]
相应地，本发明还公开了一种四价流感病毒疫苗，通过上述方法制备得到。
[0022]
本发明的有益效果是：
[0023]
本发明实施例通过在四价流感病毒鸡胚培养工艺的冷胚步骤之前，实施速冻步骤，即在在
‑
20
±
5℃条件下，冷冻0.5
‑
1.5小时，从而大幅缩短了生产时间，提高了收获液的血凝滴度和病毒滴度并降低了杂蛋白含量，使得料液更加澄清。
具体实施方式
[0024]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0025]
本发明提供的四价流感病毒鸡胚培养工艺的一个实施例，包括建库、接种、增殖和冷胚步骤，在所述冷胚步骤之前，还包括有：
[0026]
速冻步骤：在
‑
20
±
5℃条件下，冷冻0.5
‑
1.5小时。
[0027]
作为一些可能的实施方式，所述建库步骤包括：
[0028]
将病毒种子经缓冲液稀释至适宜浓度后，接种9
‑
11日龄spf鸡胚培养，收获尿囊液；其中，所述缓冲液为ph值＝8.0、添加了蔗糖的磷酸盐缓冲液，其蔗糖含量以质量计为2％
‑
5％。
[0029]
作为一些可能的实施方式，所述建库步骤具体包括：
[0030]
主种子批建库：原始种子开启，经所述缓冲液稀释至3.0
‑
7.0lg eid
50
/ml浓度后，接种9
‑
11日龄spf鸡胚，在33
‑
35℃条件下，对甲型流感病毒培养48
‑
54小时、对乙型流感病毒培养60
‑
66小时，收获尿囊液。
[0031]
作为一些可能的实施方式，所述建库步骤还包括：
[0032]
工作种子批建库：主种子批经所述缓冲液稀释至3.0
‑
7.0lg eid
50
/ml浓度后，接种9
‑
11日龄spf鸡胚，在33
‑
35℃条件下，对甲型流感病毒培养48
‑
54小时、对乙型流感病毒培养60
‑
66小时，收获尿囊液。
[0033]
作为一些可能的实施方式，在所述建库步骤中，每次收获尿囊液之前，均执行一次所述速冻步骤和冷胚步骤。
[0034]
作为一些可能的实施方式，所述接种步骤具体包括：
[0035]
取工作种子批病毒种子，用缓冲液将工作种子批毒种稀释成5.0～7.0lg eid
50
/ml。
[0036]
作为一些可能的实施方式，所述增殖步骤具体包括：
[0037]
按照每胚0.2
±
0.05ml接种量，在培养温度34
±
1℃、湿度65
±
10％条件下，培养48
‑
72小时。
[0038]
作为一些可能的实施方式，所述冷胚步骤具体包括：2
‑
8℃冷胚5
‑
10小时后，收获尿囊液。
[0039]
本发明实施例提供的四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，其鸡胚尿囊培养工艺可其采用如前述实施例所述的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊培养工艺，其余工艺可与现有技术基本相同。
[0040]
本发明实施例提供的四价流感病毒裂解疫苗，可通过前述实施例所述的制备方法制备得到。
[0041]
为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例的四价流感病毒裂解疫苗鸡胚尿囊培养工艺的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。
[0042]
实施例1
[0043]
主种子批建库：原始种子开启，经ph值＝8.0、添加了2
‑
5％蔗糖(质量比)的磷酸盐缓冲液稀释至3.0
‑
7.0lg eid
50
/ml浓度，接种9
‑
11日龄spf鸡胚，33
‑
35℃培养，对甲型流感病毒培养48
‑
54小时，对乙型流感病毒培养60
‑
66小时；
‑
20
±
5℃速冷0.5
‑
1.5小时后，转移至2
‑
8℃冷胚5
‑
10小时，收获尿囊液。
[0044]
工作种子批建库：主种子批经ph 8.0+2％蔗糖磷酸盐缓冲液稀释至3.0
‑
7.0lg eid
50
/ml浓度，接种到9
‑
11日龄spf鸡胚，33
‑
35℃培养，对甲型流感病毒培养48
‑
54小时，对乙型流感病毒培养60
‑
66小时；
‑
20
±
5℃速冷0.5
‑
1.5小时后，转移至2
‑
8℃冷胚5～10小时，收获尿囊液。
[0045]
病毒接种：取工作种子批毒种，用ph值＝8.0、添加了2
‑
5％蔗糖(质量比)的磷酸盐缓冲液将工作种子批毒种稀释成5.0
‑
7.0lg eid
50
/ml。
[0046]
病毒增殖：接种量每胚0.2
±
0.05ml；培养温度34
±
1℃，培养时间48h
‑
72h，湿度65
±
10％。
[0047]
病毒收获：
‑
20
±
5℃速冷0.5
‑
1.5后，转移至2
‑
8℃冷胚5～10h，收获尿囊液。
[0048]
其各项指标与现有技术对比结果如下表1、表2和表3所示。
[0049]
表1、工作种子批血凝滴度和病毒滴度
[0050][0051]
表2、收获液蛋白质含量
[0052][0053]
表3、收获液血凝滴度(log2血凝滴度)
[0054][0055][0056]
本发明实施例通过优化的病毒稀释液ph 8.0+2％蔗糖磷酸盐缓冲液对病毒进行稀释后接种，在优化的培养时间对甲型流感病毒培养48
‑
54小时，对乙型流感病毒培养60
‑
66小时，通过优化的冷胚方式(先速冷0.5
‑
1.5h，后2～8℃冷胚5～10h)，从而达到了具有更高的血凝滴度和更高病毒滴度的种子批，生产接种时，接种量每胚0.2
±
0.05ml；培养温度34
±
1℃，培养时间48h
‑
72h，湿度65
±
10％，从而获得病毒量更高的病毒收获液，这样的收获液更澄清，具有更低的杂蛋白含量，提高了鸡胚流感疫苗产率和安全性，并且将常规的工艺冷胚时间24h，缩短至5
‑
10h，提高了工作效率。
[0057]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。