1.本发明属于化学制药领域，涉及化学药物氢化可的松的纯化提取方法。
背景技术：
2.氢化可的松是一种常用的皮质激素类药物,临床用途很广泛，主要用于治疗肾上腺功能不足，自身免疫性疾病，变态反应性疾病，以及急性白血病、眼炎及何杰金氏病，也用于某些严重感染所致的高热综合治疗等，其结构式如下：
[0003][0004]
其现行的生产工艺有合成和发酵两种，中国专利公开号cn110804640a提出一种氢化可的松的生产发酵工艺，其发酵及转化操作过程后得到的发酵转化液中包含有一定含量的表氢化可的松、未转化的rsa及其他杂质。表氢化可的松作为氢化可的松的异构体，基本没有药效，其作为主要的副产物难以从发酵液中与氢化可的松分离，其结构式如下：
[0005][0006]
由于异构体表氢化可的松的存在，如何提高氢化可的松的提取纯度一直成为制约发酵法工业提取的瓶颈。
[0007]
传统的发酵工艺提取方式多以溶剂萃取法来提取发酵后生成的氢化可的松，所用的萃取剂是醋酸丁酯或醋酸异丁酯，一般采用多次反复萃取的策略，该方法虽然能够回收更多的目的产物，但过程中耗费大量萃取剂，根据文献“用离心萃取器连续逆流提取氢化可的松的研究[j]”(精细化工,2001,第18卷第1期)报道的六级错流中，醋酸丁酯体积比0.9∶1对发酵液进行萃取，收率68.1％，醋酸丁酯的总使用量根据发酵液体量成正比，损耗巨大，虽然萃取剂可回收利用，但回收过程但费时费力，同时产生大量工业废水，增加了污水处理的负担，给氢化可的松的实验室研究和工业化生产带来了极大的困难。
[0008]
因此，开发一种新的发酵液氢化可的松的纯化提取方法具有十分重要的现实意义。
技术实现要素：
[0009]
本发明是提供一种氢化可的松的提取方法，以至少解决现有技术中出现的诸多问题之一。
[0010]
鉴于此，本发明的方案如下：
[0011]
一种氢化可的松的纯化提取方法，包括如下步骤：发酵液过滤后浓缩，浓缩液经稀释后采用大孔吸附树脂进行吸附，经洗脱后，洗脱液经浓缩水洗析晶后获得氢化可的松。
[0012]
根据本发明的实施例，所述大孔吸附树脂为ab
‑
8。
[0013]
根据本发明的实施例，所述大孔吸附树脂与浓缩液的体积比为0.1
‑
0.2；所述大孔吸附树脂的径高比为1：(1
‑
8)，所述浓缩液上柱的流速为0.5～1.0bv/h。
[0014]
根据本发明的实施例，所述洗脱溶剂采用乙酸丁酯，用量为所述浓缩发酵液体积的1
‑
1.5倍，洗脱速度为0.5～1.5bv/h。
[0015]
根据本发明的实施例，所述发酵液调节至6.5
‑
7.5后再过滤。
[0016]
根据本发明的实施例，所述浓缩采用刮板薄膜蒸发器，收集下层重组分；进一步地，所述浓缩步骤将发酵液浓缩至原有体积的1/3～1/4。
[0017]
根据本发明的实施例，所述洗脱液经水洗后，对溶剂相浓缩至氢化可的松湿品析出后转0
‑
5℃冷冻，待完全析出后离心，用冷冻乙酸丁酯浇洗甩干，干燥，得氢化可的松。优先地，所述浓缩过程在真空条件下保持80
±
10℃馏除乙酸丁酯。
[0018]
相比现有技术，本发明的有益效果为：
[0019]
1.本发明所述纯化提取方法通过多级协同操作，逐步提升氢化可的松的提取纯度，提取过程不会采用大量的萃取剂，可减少废水排放，生产成本低，适于工业化应用。
[0020]
2.本发明所述纯化提取方法可以明显降低表氢化可的松的含量，对于提高产品质量有显著的意义。
具体实施方式
[0021]
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
[0022]
本发明提出一种氢化可的松的提取方法，包括如下步骤：
[0023]
1.发酵液采用10％硫酸溶液调整ph值为6.5
‑
7.5，后经过滤去除菌丝后得到滤液。
[0024]
2.选用刮板薄膜蒸发器进行浓缩，获取重组分。具体操作步骤为：将滤液投入到进料罐中，用进料泵将提取液泵入到刮板薄膜蒸发器中，设定并控制刮板薄膜蒸发器加热温度，打开刮板薄膜蒸发器搅拌电机，水环式真空泵对刮板薄膜蒸发器进行抽真空，在冷凝器中通入冷却介质，利用刮板式薄膜蒸发器对提取液进行浓缩，至原有体积的1/3～1/4，注意实时观测，防止浓缩过量，造成培养基内的营养组分因浓缩过分产生质变从而影响后续的提取，浓缩终止后浓缩液进提取罐待提取。
[0025]
3.采用大孔吸附树脂对浓缩液进行吸附，大孔吸附树脂可选择常见的一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，如ab
‑
8，所述大孔吸附树脂柱的径高比为1：1～8；所述大孔吸附树脂主要用于吸附发酵液中有效成分氢化可的松。树脂的用量为发酵液体积的0.1～0.2倍，上柱的流速为0.5～1.0bv/h。若大孔吸附树脂用量过少、上柱的流速过快或
高径比过小，有效成分将无法充分吸附；若大孔吸附树脂用量过多、上柱的流速过慢或高径比过大，都将延长生产的周期并增加生产的成本。
[0026]
4.采用乙酸丁酯对吸附后树脂进行洗脱，合并洗脱液。乙酸丁酯的用量是发酵液体积的1
‑
1.5倍，洗脱速度为0.5～1.5bv/h。
[0027]
5.洗脱液经纯水水洗后，溶剂相转在浓缩罐中浓缩至氢化可的松湿品大量析出后转0
‑
5℃冷冻，保温1小时左右，离心，用冷冻乙酸丁酯浇洗甩干，干燥，得氢化可的松提取物。
[0028]
本发明设计上述提取方法的原理为：
[0029]
1.调节发酵液的ph值目的在于一方面可以避免碱性条件下化合物出现不稳定的现象，为后期提取过程创造了稳定的酸碱环境；另一方面可以析出少量的杂质避免后续进入大孔吸附树脂中影响吸附性能；
[0030]
2.在提取前先以刮板薄膜蒸发器进行浓缩，一方面可以去除发酵液中的少量轻组分，进一步降低后续吸附过程杂质的影响，另一方面使得滤液体积减少至原有体积的1/3～1/4，发酵液体积缩减降低了废水排放量，更有利于工业化生产，另一方面适当提高发酵液的浓度，有利于后续大孔树脂吸附的效率；
[0031]
3.根据甾体立体化学，氢化可的松的11β羟基时轴向取代基，而表氢化可的松的11α羟基则是赤道取代基，和氢化可的松相比，表氢化可的松的环二和环三空间结构使得偏离船式构象，表氢化可的松表现出更大的空间位阻，因此11α羟基发生氢键吸附作用比11β羟基更弱，从而导致氢化可更容易被吸附。采用大孔吸附树脂材料的原因在于，选择弱极性树脂材料，发酵液成分相对于极性介质(如乙醇或水)更易被弱极性吸附剂吸附，氢化可的松分子尽管有几个极性基团，但相对于庞大的非极性甾核而言，整个分子仍呈弱极性。因此在醇水体系中，采用非极性或弱极性的吸附树脂效果会更好。另外，氢化可的松的分子量较大，且甾核为平面结构，因而对孔径有一定的要求，此外吸附剂的内表面积越大吸附能力越强，如大孔吸附树脂ab
‑
8具备高交联度、高比表面积、不带有官能团的非极性等性能，其连续的孔结构赋予其优异的吸附性能，此外ab
‑
8的聚合物结构使其具有优良的物化性能和热稳定性，再生能力强，适用于工业生产中。
[0032]
4.采用乙酸丁酯作为解析溶剂的原因在于，乙酸丁酯相对于氢化可的松及表氢化可的松而言具备明显不同的分配系数。根据甾体立体化学，表氢化可的松中的11α羟基与溶剂的作用比氢化可的松的11β羟基更弱，从而导致表氢化可的松的分配系数更低。在乙酸丁酯中具备较高的分离系数，氢化可的松与表氢化可的松的解析量不同，因此可以进一步降低提取过程中表氢化可的松的含量。
[0033]
本发明中，ab
‑
8大孔吸附树脂为美国杜笙tulsimer。装柱之前，使用清水对树脂交换柱管道内进行清洗，清理部分附着的杂质，然后向柱内注1/3的水，取少量树脂，将树脂从交换柱顶部人孔处装入柱内观察是否有树脂泄露。检查完毕后，将树脂加入柱内进行预处理，先采用1mol/lnaoh液浸泡清洗3h，再采用纯水浸泡后并清洗至中性，清除树脂孔道内残留的有机分子、致孔剂等，直至清洗出口液体或浸泡液无浑浊、无味后待用。
[0034]
本发明中，所述发酵原液中氢化可的松的检测含量为1.8g/l。
[0035]
实施例1
[0036]
将发酵转化液约用10％的硫酸溶液调整ph至7.5，经过滤去除菌丝后得到滤液约
45l，将提取液投入到进料罐中，用进料泵将提取液泵入到刮板薄膜蒸发器中，设定并控制刮板薄膜蒸发器加热温度在75℃以上，打开刮板薄膜蒸发器搅拌电机，设置刮板线速度为1m/s，水环式真空泵对刮板薄膜蒸发器进行抽真空，在冷凝器中通入冷却介质，利用刮板式薄膜蒸发器对提取液进行浓缩，得到浓缩液约12l。
[0037]
浓缩液分阶段采用预处理后的大孔吸附树脂ab
‑
8进行吸附，吸附柱的径高比为1：1；树脂的用量为1.2l，上柱的流速为0.5bv/h。用乙酸丁酯对吸附后树脂进行洗脱，乙酸丁酯的用量为12l，洗脱速度为0.5bv/h。
[0038]
将洗脱液转移至水洗罐，向其中注入纯化水约10l水洗分层后，溶剂层转入50l浓缩罐中浓缩，控制真空度在温度80
±
10℃下收集乙酸丁酯；体积约2l时氢化可的松湿品出现大量析出后停止浓缩，转入0
‑
5℃冰箱冷却1小时，离心，用醋酸丁酯浇洗甩干，50～70℃干燥8～10小时，得到氢化可的松40.8g，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化可的松的含量为99.3％。
[0039]
实施例2
[0040]
将发酵转化液约用大约10％的硫酸溶液调整ph至6.9，经过滤去除菌丝后得到滤液约45l，将提取液投入到进料罐中，用进料泵将提取液泵入到刮板薄膜蒸发器中，设定并控制刮板薄膜蒸发器加热温度在75℃以上，打开刮板薄膜蒸发器搅拌电机，设置刮板线速度为0.5m/s，水环式真空泵对刮板薄膜蒸发器进行抽真空，在冷凝器中通入冷却介质，利用刮板式薄膜蒸发器对提取液进行浓缩，得到浓缩液约15l。
[0041]
浓缩液分阶段采用预处理后的大孔吸附树脂ab
‑
8进行吸附，吸附柱的径高比为1：2；树脂的用量为2l，上柱的流速为0.8bv/h。用乙酸丁酯对吸附后树脂进行洗脱，乙酸丁酯的用量为18l，洗脱速度为1.0bv/h。
[0042]
将洗脱液转移至水洗罐，向其中注入纯化水约12l水洗分层后，溶剂层转入50l浓缩罐中浓缩，控制真空度在温度80
±
10℃下收集乙酸丁酯；体积约2l时氢化可的松湿品出现大量析出后停止浓缩，转入0
‑
5℃冰箱冷却1小时，离心，用醋酸丁酯浇洗甩干，50～70℃干燥8～10小时，得到氢化可的松41.1g，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化可的松的含量为99.7％。
[0043]
实施例3
[0044]
将发酵转化液约用大约10％的硫酸溶液调整ph至6.5，经过滤去除菌丝后得到滤液约45l，将提取液投入到进料罐中，用进料泵将提取液泵入到刮板薄膜蒸发器中，设定并控制刮板薄膜蒸发器加热温度在75℃以上，打开刮板薄膜蒸发器搅拌电机，设置刮板线速度为0.8m/s，水环式真空泵对刮板薄膜蒸发器进行抽真空，在冷凝器中通入冷却介质，利用刮板式薄膜蒸发器对提取液进行浓缩，得到浓缩液约12l。
[0045]
浓缩液分阶段采用预处理后的大孔吸附树脂ab
‑
8进行吸附，吸附柱的径高比为1：8；树脂的用量为2.4l，上柱的流速为1.0bv/h。用乙酸丁酯对吸附后树脂进行洗脱，乙酸丁酯的用量为18l，洗脱速度为1.5bv/h。
[0046]
将洗脱液转移至水洗罐，向其中注入纯化水约12l水洗分层后，溶剂层转入50l浓缩罐中浓缩，控制真空度在温度80
±
10℃下收集乙酸丁酯；体积约2l时氢化可的松湿品出现大量析出后停止浓缩，转入0
‑
5℃冰箱冷却1小时，离心，用醋酸丁酯浇洗甩干，50～70℃干燥8～10小时，得到氢化可的松40.2g，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化
可的松的含量为99.4％。
[0047]
对比例1
[0048]
采用实施例3相同的方法提取发酵液中的氢化可的松，区别仅在于在于，大孔吸附树脂ab
‑
8的用量为3l。该方法得到氢化可的松40.4g，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化可的松的含量为99.4％。
[0049]
对比例2
[0050]
采用实施例3相同的方法提取发酵液中的氢化可的松，区别仅在于在于，大孔吸附树脂ab
‑
8的用量为1l。该方法得到氢化可的松35.8g，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化可的松的含量为96.3％。
[0051]
对比例3
[0052]
采用实施例3相同的方法提取发酵液中的氢化可的松，区别仅在于在于，上柱的流速为1.5bv/h，洗脱速度为1.8bv/h。该方法得到氢化可的松40.1g，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化可的松的含量为96.3％。
[0053]
对比例4
[0054]
采用实施例1相同的方法提取发酵液中的氢化可的松，区别仅在于在于，上柱的流速为0.3bv/h，洗脱速度为0.3bv/h。该方法得到氢化可的松41.3g，提纯收率93.0％，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化可的松的含量为99.6％。
[0055]
对比例5
[0056]
采用实施例1相同的方法提取发酵液中的氢化可的松，区别仅在于在于，未调整发酵液ph值，测得ph为7.9。该方法得到氢化可的松34.8g，经高效液相色谱(hplc)法测定，本实施例所得氢化可的松的含量为95.8％。
[0057]
从以上实施例1
‑
3中不难得出，本发明提出的氢化可的松的纯化提取方法，纯度可以得到99.7。对比例1中提高大孔吸附树脂的量对于纯度的提升并无影响，相反大孔吸附树脂的量过少时(对比例2)纯度明显下降。对比例3上柱流速较快会影响对杂质吸附率，解析流速较快会破坏杂质吸附平衡进而影响最终提取液纯度。对比例4上柱流速及解析速度均比较慢，但纯度提升幅度不大，其效率低下而不适用于生产中。对比例5中发酵液未调整ph值，呈弱碱性，此时部分杂质无法通过过滤去除、也无法通过后续大孔树脂吸附去除，此外目标成分氢化可的松在弱碱性条件下对大孔吸附树脂材料的吸附力减弱，两种因素均会影响氢化可的松的最终纯度。
[0058]
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的实验示例和这里示出与描述的示例。