碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用

1.本发明涉及基因工程领域，特别地，涉及一种碱性蛋白酶基因。此外，本发明还涉及杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.蛋白酶能够分解蛋白质形成多肽以及游离氨基酸，在许多领域具有广泛的应用前景。蛋白酶来源广泛，目前产业化应用的蛋白酶主要来源于微生物，微生物来源蛋白酶具有种类多、酶学特性多样等特点。微生物来源的蛋白酶，根据作用ph可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。这三种蛋白酶根据各自不同的酶学性质分别应用于不同的工业领域。其中碱性蛋白酶作为一种丝氨酸蛋白酶，具有良好的活性和稳定性，能够有效分解各种蛋白质，目前主要应用于食品加工、洗涤以及饲料等领域。碱性蛋白酶作为一种常用的工业酶制剂，市场上主流的碱性蛋白酶产品则是来源于嗜碱芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌。碱性蛋白酶的生产方式则主要分为天然菌发酵培养和异源高效表达两大类。天然菌发酵培养的优点是发酵周期短，缺点则是酶活低、发酵过程不稳定及培养基组成复杂、菌种容易退化等。相对于天然菌，异源重组表达具备发酵酶活高、发酵过程稳定可控等优点，因此其成为主流的生产方式。目前碱性蛋白酶异源表达宿主包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌表达宿主的研究最多。枯草芽孢杆菌作为一种食品级表达宿主具有遗传操作简单、基因背景清晰、胞外分泌蛋白等优点。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用，以解决来源于芽孢杆菌的碱性蛋白酶的生产成本高、碱性蛋白酶发酵活力低的技术问题。
4.本发明采用的技术方案如下：
5.一种碱性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.通过同源克隆获得环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp。参照细菌基因组提取试剂盒提取环状芽孢杆菌基因组sy1(环状芽孢杆菌sy1由实验室前期从豆渣里面筛选获得)，根据ncbi数据库bacillus circulans strain nctc2610基因组序列(genbank:uapz01000012.1：120935
‑
122077)设计一对引物，即正向引物的核苷酸序列如seq id no：20所示(bc1
‑
fw，5'
–
tcacggccg atgaagaaactgttgacgaaa
‑
3'，下划线为ec52i酶切位点)，反向引物的核苷酸序列如seq id no：21所示(bc1
‑
rev：5'
‑
acgtctagagcgtgttgccgcttctgc
‑
3'，下划线为xbai酶切位点)。以提取的基因组为模板，通过pcr扩增获得碱性蛋白酶基因bcp。
7.上述碱性蛋白酶基因bcp为环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，编码性蛋白酶bcp的380个氨基酸，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.根据本发明的另一方面，还提供了一种碱性蛋白酶bcp，其氨基酸序列如seq id no.2所示。通过分析，基因bcp编码的碱性蛋白酶bcp可以分成三段，前27个氨基酸为其信号肽序列，28位氨基酸到111位氨基酸为其前导肽，112位氨基酸到269位氨基酸为其成熟肽(请确认，此处是否需要修改)。
9.通过ncbi蛋白比对分析发现碱性蛋白酶bcp与环状芽孢杆菌nctc2610碱性蛋白酶(蛋白登录号：no.spu21234.1)相似性最高，为90％；其次分别为克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(蛋白登录号：wp_094423791)和巴塔哥尼亚芽孢杆菌碱性蛋白酶(蛋白登录号：wp_094190329.1)，相似性分别为89.4％和78.7％。通过同源建模获得碱性蛋白酶bcp蛋白三维结构，由图1可知，bcp催化活性位点由第143位的天冬氨酸(d143)，第173位的组氨酸(h173)和第326位的丝氨酸(s326)催化三联体构成。蛋白表面的两段氨基酸之环(g
209
到s
215
，l
233
到s
239
)负责结合底物进行反应。此外bcp成熟肽还存在两个ca
2+
结合位点，一个在蛋白表面，一个处于蛋白中间。
10.根据本发明的另一方面，还提供了一种用于在枯草芽孢杆菌中高效表达碱性蛋白酶的杂合启动子，杂合启动子的核苷酸序列如seq id no.11所示。杂合启动子的构建方法包括以下步骤：(1)pcr扩增获得碱性蛋白酶基因bcp，再通过琼脂糖凝聚纯化后用限制性内切酶xbai和eco521进行酶切，将酶切后的产物纯化，连接至表达载体phy，通过筛选以及测序最终获得表达载体phy
‑
bcp。(2)以构建好的phy
‑
bcp为模板，分别构建不同启动子表达载体。筛选的启动子包括：p
cryiiia
(苏云金芽孢杆菌结晶蛋白启动子)、p
bsamy(
枯草芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)、p
baamy
(解淀粉芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)、p
hpaii(
来源于表达载体pma5q)、p
gsib
(来源于枯草芽孢杆菌)、p
bsapr
(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子)，p
bsnpr
(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子)和p
blapr
(地衣芽孢碱性蛋白酶启动子)，启动子的核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.10所示。(3)采用电转化法将所有不同启动子表达载体转入枯草芽孢杆菌rik1285，获得多个转化子。(4)多个转化子培养后进行酶活筛选，以确定单一最优启动子。(5)以单一最优启动子作为模板构建杂合启动子，重复步骤(3)、(4)，获得杂合启动子。杂合启动子为phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
bcp，其对应的重组工程菌的酶活为2210u/ml，其核苷酸序列如seq id no.11所示。
11.根据本发明的另一方面，还提供了一种重组表达载体，包括上述碱性蛋白酶基因bcp、权利要求3的杂合启动子和信号肽，信号肽的核苷酸序列如seq id no.15所示。启动子和信号肽作为枯草芽孢杆菌重组表达的核心元件，在异源蛋白重组表达过程中发挥着重要作用。不同的酶对启动子和信号肽有选择性，因此蛋白酶在枯草芽孢进行异源表达，通过筛选获得最适启动子和信号肽。信号肽对其进行优化能够进一步提升碱性蛋白酶bcp在枯草芽孢杆菌rik1285的表达量。所选的信号肽包括：sp
bsamy
(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶信号肽)、sp
bsapr
(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽)、sp
bsnpr
(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽)、sp
bschi
(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)、sp
dacb
(枯草芽孢杆菌dacb信号肽)、sp
vpr
(枯草芽孢杆菌vpr信号肽)、sp
yncm
(枯草芽孢杆菌yncm信号肽)和sp
ap
(枯草芽孢杆菌氨肽酶信号肽)，其核苷酸序列如seq id no.12～seq id no.19所示。分别将不同信号肽表达载体转入枯草芽孢杆菌rik1285，筛选转化子，确定最佳信号肽，试验结果可知，sp
bschi
(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)效果最好，其对应的重组工程菌发酵酶活最高，培养48小时酶活为2650u/ml，其次为spbsamy和spbsnpr多对应的重组工程菌，酶活分别为2452u/ml和2345u/ml。重组表
达载体为phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
sp
bschi
‑
bcp。
12.根据本发明的另一方面，还提供了一种重组表达工程菌，包括上述重组表达载体。以游离质粒表达的方式，在经过多次传代后重组工程菌的发酵酶活会显著降低，因此需要把最优重组表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
sp
bschi
‑
bcp整合到枯草芽孢杆菌rik1285基因组上。重组表达工程菌种bs16
‑
5在7升发酵罐培养48小时后发酵活力达到最高为51807u/ml；在50升发酵罐培养48小时后发酵酶活为53708u/ml。
13.根据本发明的另一方面，还提供了一种上述碱性蛋白酶bcp的制备方法，包括以下步骤：
14.提供碱性蛋白酶基因bcp、表达载体和表达菌株；
15.对碱性蛋白酶基因bcp进行扩增，扩增产物与表达载体进行连接，获得重组表达载体；
16.将重组表达载体基因整合到表达菌株，获得重组表达工程菌；
17.对重组表达工程菌进行培养，获得碱性蛋白酶bcp；
18.其中，碱性蛋白酶基因bcp的核苷酸序列如seq id no：1所示。
19.本发明的碱性蛋白酶bcp的制备方法，首先通过同源克隆获得了碱性蛋白酶bcp编码基因bcp，其次通过启动子和信号肽优化以及整合型表达获得高效重组枯草芽孢杆菌工程菌bs16
‑
5，最后通过高密度发酵实现碱性蛋白酶bcp的高效制备，为碱性蛋白酶bcp的产业化应用奠定基础。
20.进一步地，表达载体包括载体phy、杂合启动子和信号肽；和/或，表达菌株为枯草芽孢杆菌rik1285。
21.进一步地，重组表达载体基因整合到枯草芽孢杆菌rik1285的中温淀粉酶基因位点。
22.进一步地，碱性蛋白酶基因bcp进行扩增的过程中，用于扩增的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq id no：20所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no：21所示。
23.根据本发明的另一方面，还提供了一种上述碱性蛋白酶bcp在水解蛋白质中的应用，碱性蛋白酶bcp的反应温度为20℃～70℃；碱性蛋白酶bcp的反应ph值为7～11。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明的碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，在枯草芽孢杆菌表达菌株中进行高效表达，从而降低碱性蛋白酶bcp的生产成本。
26.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
27.构成本技术的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
28.图1是本发明优选实施例的碱性蛋白酶bcp的三维结构图；
29.图2是本发明优选实施例的重组表达载体的优化路线图；
30.图3是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌bs16
‑
5在7升发酵罐培养产酶曲线图；
31.图4是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌bs16
‑
5在50升发酵罐培养产酶曲线图；
32.图5是本发明优选实施例的碱性蛋白酶bcp的反应温度特性图；以及
33.图6是本发明优选实施例的碱性蛋白酶bcp的ph特性图。
具体实施方式
34.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
35.图1是本发明优选实施例的碱性蛋白酶bcp的三维结构图；图2是本发明优选实施例的重组表达载体的优化路线图；图3是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌bs16
‑
5在7升发酵罐培养产酶曲线图；图4是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌bs16
‑
5在50升发酵罐培养产酶曲线图；图5是本发明优选实施例的碱性蛋白酶bcp的反应温度特性图；以及图6是本发明优选实施例的碱性蛋白酶bcp的ph特性图。
36.实施例
37.大肠杆菌菌株topl0和枯草芽孢杆菌rik1285均购自宝生物公司。
38.环状芽孢杆菌sy1由实验室前期从豆渣里面筛选获得。
39.表达载体phy由本课题组前期实验构建且常规保存于
‑
80℃冰箱。
40.高保真q5酶，购自neb公司。
41.质粒提取、胶纯化、限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。
42.大肠杆菌和枯草芽孢杆菌rik1285培养基为lb液体和固体培养基，lb液体培养基组成成分如下：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0；固体培养基则是在液体培养基的基础上添加了2.5％琼脂粉。
43.大肠杆菌和枯草芽孢杆菌rik1285筛选培养基为液体lbk和固体lbk培养基，主要用于大肠杆菌重组转化子和枯草芽孢杆菌重组转化子的筛选。液体lbk配置：在灭好菌的lb液体培养基加入30μg/ml卡那霉素，获得液体lbk培养基；固体lbk培养基：将灭好菌的固体lb培养基加热溶解，待培养基温度降至50℃，按照30μg/ml加入卡那霉素，倒板，获得固体lbk培养基。
44.枯草芽孢发酵培养基为麦芽糖培养基，其组成成分如下：酵母浸膏2.5％、蛋白胨1.5％、麦芽糖4％、柠檬酸钠1％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾1％。
45.高密度发酵培养基，其组成成分如下：麦芽糖7％、豆粕2.5％、酵母粉1.5％、麸皮2％、磷酸氢二钾1％、柠檬酸三钠0.3％、氯化钙0.3％。
46.实施例1
47.碱性蛋白酶基因bcp基因克隆及表达载体构建
48.参照细菌基因组提取试剂盒提取环状芽孢杆菌基因组sy1，根据ncbi数据库bacillus circulans strain nctc2610基因组序列(genbank:uapz01000012.1：120935
‑
122077)设计一对引物，正向引物的核苷酸序列如seq id no：20所示(bc1
‑
fw，5'
–
tcacggccgatgaagaaactgttgacgaaa
‑
3'，下划线为ec52i酶切位点)，反向引物的核苷酸序列如seq id no：21所示(bc1
‑
rev：5'
‑
acgtctagagcgtgttgccgcttctgc
‑
3'，下划线为xbai酶切位点)，用于扩增环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp。以提取的基因组为模板，通过pcr扩增获得碱性蛋白酶基因bcp。
49.扩增的碱性蛋白酶基因bcp通过琼脂糖凝聚纯化后用限制性内切酶xbai和eco521进行酶切，将酶切后的产物纯化，连接至表达载体phy，将连接产物转化至大肠杆菌top10，转化产物均匀涂布于lbk固体培养基。转化子的筛选采用菌液pcr法，如下：(1)将转化子以单菌落的形式接入含有300μl lbk液体培养基的2ml灭菌离心管，37℃，200rpm培养5小时；(2)以培养好的菌液为模板，以引物bc1
‑
fw和bc1
‑
rev进行pcr扩增，将扩增结果正确的转化子接入lbk液体培养基进行培养，提取质粒；(3)通过测序验证，最终获得表达载体phy
‑
bcp。
50.实施例2
51.单启动子优化
52.以构建好的表达载体phy
‑
bcp为模板，分别构建不同启动子表达载体。筛选的启动子包括：p
cryiiia
(苏云金芽孢杆菌结晶蛋白启动子)、p
bsamy
(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)，p
baamy
(解淀粉芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)，p
hpaii
(来源于表达载体pma5q)，p
gsib
(来源于枯草芽孢杆菌)、p
bsapr
(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子)，p
bsnpr
(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子)和p
blapr
(地衣芽孢碱性蛋白酶启动子)，启动子的核苷酸序列如seq id no.3～seq id no.10所示，所有启动子序列均由通用生物公司进行合成，基因合成过程中在启动子序列两端均加上了eco52i和mlui酶切位点。
53.如图2所示，具体步骤如下(以phy
pcryiiia
‑
bcp为例，其它类同)：首先用限制性内切酶eco52i和mlui分别酶切表达载体ph
y
‑
bcp
和合成的启动子p
cryiiia
质粒；其次通过琼脂糖凝聚分别回收主框架phy(不含有phy自带启动子p43)以及p
cryiiia
启动子，并且将p
cryiiia
启动子连接至主框架phy，转入大肠杆菌top10；最后通过菌落pcr、测序验证确定获得表达载体phyp
cryiiia
‑
bcp。依次方法分别获得phyp
cryiiia
‑
bcp、phyp
bsamy
‑
bcp、phyp
baamy
‑
bcp、phyp
hpaii
‑
bcp、phyp
gsib
‑
bcp、phyp
bsapr
‑
bcp、phyp
bsnpr
‑
bcp、phyp
blapr
‑
bcp，共8个表达载体。
54.采用电转化法将8个表达载体转入枯草芽孢杆菌rik1285。转化过程如下：(1)从37℃培养16h～20h的平板中挑取一个单菌落(直径2mm～3mm)，转到一个含有5ml lb培养基的50ml ep管中，37℃剧烈振摇过夜；(2)1％接种量接种于50mlgm(lb+0.5m山梨醇)，测量摇管内od，控制好接种量，使接种完毕后培养基的od在0.19～0.2之间，37℃，200rpm培养至od600＝0.8～1.0(大约3～4小时)左右；(3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体；(4)用30ml预冷的电转缓冲液etm(0.5m山梨醇，0.5m甘露醇，10％甘油，可以加入0.5m海藻糖提高效率)洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次；(5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的etm中，每管分装100μl；(6)将100μl感受态细胞中加入1～6μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次，电转仪设置：1.5～2.0kv，25μf，200ω，1mm，电击1次(持续时间4.5ms～5ms之间)；(7)电击完毕立即加入0.5ml复苏培养基rm(lb+0.5m山梨醇+0.38甘露醇)，37℃，120rpm，复苏3h后，涂lbk固体平板，37℃，过夜培养。
55.转化子筛选，采用摇瓶培养进行筛选，分别将含有不同启动子表达载体的枯草芽孢杆菌rik1285接入含有5ml枯草芽孢发酵培养基的50ml离心管，37℃，200rpm培养24小时后，按照5％的接种量接入含有50ml枯草芽孢发酵培养基的500ml摇瓶中。37℃，200rpm培养48小时后测定酶活。酶活测定方法参照国标gb/t 23527
‑
2009碱性蛋白酶进行。
56.实验结果如表1所示，由表1可知，含有启动子p
cryiiia
的枯草芽孢杆菌酶活最高为1852u/ml，其次为启动子p
bsapr
和启动子p
baamy
，酶活分别为1455u/ml和1415u/ml。
57.表1不同启动子表达的酶活
[0058][0059]
实施例3
[0060]
双启动子优化
[0061]
根据实施列2的结果进行双启动子优化，由于启动子pcryiiia酶活最高，以表达载体phyp
cryiiia
‑
bcp作为模板构建双启动子表达载体，与其他四个启动子p
bsapr
、p
baamy
、p
bsamy
和p
hpaii
进行配合。双启动子表达载体构建过程如下(以双启动子表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
bcp为例)：(1)以表达载体phyp
cryiiia
‑
bcp为模板，通过引物双
‑1‑
fw和双
‑1‑
rev，核苷酸序列如seq id no.22～seq id no.23所示，进行pcr扩增获得主框架1；(2)以表达载体phyp
bsapr
‑
bcp为模板，通过引物p
bsapr
‑
fw和p
bsapr
‑
rev进行pcr扩增获得启动子p
bsapr
；(3)通过无缝克隆方法将启动子p
bsapr
和主框架1进行融合，获得双启动子表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
bcp。
[0062]
此部分所有引物序列下所示(5'
‑
3')：
[0063]
主框架1引物，双
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.22)：tcgaaacgtaagatgaaacct，双
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.23)：acgcgttcagaccagtttttaa。
[0064]
p
bsapr
引物，p
bsapr
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.24)：aaaaactggtctgaacgcgttatttcttcctccctctcaat，p
bsapr
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.25)：ggtttcatcttacgtttcgatctttaccctctccttttaaa。
[0065]
p
baamy
引物，p
baamy
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.26)：aaaaactggtctgaacgcgtgccccgcacatacgaaaagac，p
baamy
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.27)：ggtttcatcttacgtttcgagtttcctctccctctcatttt。
[0066]
p
bsamy
引物，p
bsamy
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.28)：aaaaactggtctgaacgcgtccgagaatggacaccaaaga，p
bsamy
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.29)：ggtttcatcttacgtttcgatcttgacactccttatttgat。
[0067]
p
hpaii
引物，p
hpaii
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.30)：aaaaactggtctgaacgcgtgggcgcgattgctgaataaaag，p
hpaii
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.31)：ggtttcatcttacgtttcgaatgtaaatcgctccttttta
[0068]
分别将双启动子表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
bcp、phyp
baamy
‑
cryiiia
‑
bcp、phyp
bsamy
‑
cryiiia
‑
bcp和phyp
hpaii
‑
cryiiia
‑
bcp转入枯草芽孢杆菌rik1285，转化过程与重组转化子的筛选方法同实施列2相同，测定酶活。
[0069]
实验结果可知，phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
bcp，phyp
baamy
‑
cryiiia
‑
bcp，phyp
bsamy
‑
cryiiia
‑
bcp和
phyp
hpaii
‑
cryiiia
‑
bcp对应重组工程菌的酶活分别为2210u/ml、1985u/ml、1850u/ml和2042u/ml。
[0070]
表2不同启动子表达的酶活
[0071][0072]
实施例4
[0073]
信号肽优化
[0074]
信号肽选自包括：sp
bsamy
(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶信号肽)、sp
bsapr
(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽)、sp
bsnpr
(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽)、spbschi(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)、sp
dacb
(枯草芽孢杆菌dacb信号肽)、sp
vpr
(枯草芽孢杆菌vpr信号肽)、sp
yncm
(枯草芽孢杆菌yncm信号肽)和sp
ap
(枯草芽孢杆菌氨肽酶信号肽)，核苷酸序列如seq id no.12～seq id no.19所示。
[0075]
以双启动子最优载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
bcp为模板构建不同信号肽表达载体，构建过程如下(以表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
sp
bschi
‑
bcp为例)：(1)以表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
bcp为模板，通过引物信
‑
fw和信
‑
rev扩增获得主框架2；(2)通过pcr方式将引物sp
bschi
‑
fw和sp
bschi
‑
rev合成信号肽sp
bschi
；(3)采用无缝克隆将sp
bschi
和主框架2进行连接获得表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
sp
bschi
‑
bcp。
[0076]
此部分所有引物序列下所示：
[0077]
主框架2引物，信
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.32)：gctgaggaagcaaatgaaaaat，信
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.33)：cggccgcttttcataatacataa。
[0078]
sp
bsamy
引物，sp
bsamy
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.34)：tattatgaaaagcggccgatgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttat，sp
bsamy
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.35)：ttcatttgcttcctcagcagcactcgcagccgccggtcctgccagaaccaaatgaaacagcaataaaaatcca。
[0079]
sp
bsapr
引物，sp
bsapr
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.36)：tattatgaaaagcggccggtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgtta，sp
bsapr
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.37)：ttcatttgcttcctcagcagcctgcgcagacatgttgctgaacgccatcgtaaagattaacgttaa。
[0080]
sp
bsnpr
引物，sp
bsnpr
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.38)：tattatgaaaagcggccggtgggtttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgttt，sp
bsnpr
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.39)：ttcatttgcttcctcagcagcctgaacacctggcaggctgattgataaactcataaacgaagc。
[0081]
sp
bschi
引物，sp
bschi
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.40)：tattatgaaaagcggccgatgaaaaaagtgttttcaaacaaaaagtttctcgttttttctttcatttttgcga，sp
bschi
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.41)：ttcatttgcttcctcagcggcttttgcactttccccattaaaaaaagacagacttaaaatcatcgcaaaaatg。
[0082]
sp
dacb
引物，sp
dacb
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.42)：tattatgaaaagcggccgatgcgc
attttcaaaaaagcagtattcgtgatcatgatttctttt，sp
dacb
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.43)：ttcatttgcttcctcagcagcatgtgctgtattcacatttacggttgcaataagaaaagaaat。
[0083]
sp
vpr
引物，sp
vpr
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.44)：tattatgaaaagcggccgatgaaaaaggggatcattcgctttctgcttgtaagtttcgtcttatttttt，sp
vpr
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.45)：ttcatttgcttcctcagcagccggagctgcctgaacgcccgtaatgcctgtggataacgcaaaaaataag。
[0084]
sp
yncm
引物，sp
yncm
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.46)：tattatgaaaagcggccgatggcgaaaccactatcaaaagggggaattttggtgaaaaaagtattgattgcaggtgcagtaggaacag，sp
yncm
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.47)：ttcatttgcttcctcagcagcgtctgccgcgggtaaacctggtatacctgatgaaagggttccgaaaagaactgctgttcctactgca。
[0085]
sp
ap
引物，sp
ap
‑
fw的核苷酸序列(seq id no.48)：tattatgaaaagcggccgatgaaaaagcttttgactgtcatgacgatggctgttttaactgccggcac，sp
ap
‑
rev的核苷酸序列(seq id no.49)：ttcatttgcttcctcagcagcgtgcgcggcaggggtgacactctgtgccggcaagagcagtgtgccggc。
[0086]
分别将不同信号肽表达载体转入枯草芽孢杆菌rik1285，转化过程与重组转化子的筛选方法同实施列2相同，测定酶活。
[0087]
实验结果如表3所示，由表3可知，sp
bschi
(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)效果最好，其对应的重组工程菌发酵酶活最高，培养48小时酶活为2650u/ml，其次为sp
bsamy
和sp
bsnpr
多对应的重组工程菌，酶活分别为2452u/ml和2345u/ml。
[0088]
表3不同信号肽表达的酶活
[0089][0090]
实施例5
[0091]
基因整合表达
[0092]
表达载体phy能够作为基因整合载体进行整合表达，在phy载体上存在枯草芽孢杆菌中温淀粉酶5’端和3’同源臂，此外其复制子是温敏复制子。将含有phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
sp
bschi
‑
bcp重组枯草芽孢杆菌进行基因整合实验，整合实验过程大致如下：(1)在45℃下进行高温诱导，使表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
sp
bschi
‑
bcp的复制子失活，从而促使表达载体phyp
bsapr
‑
cryiiia
‑
sp
bschi
‑
bcp和枯草芽孢杆菌rik1285进行同源重组；(2)提取同源重组单菌落接入含有400μl lb液体培养基的2ml灭菌离心管，37℃，200rpm培养4小时后，95℃处理菌液作为pcr扩增模板；(3)以热处理后的菌液为模板，用5端鉴定的正向引物的核苷酸序列如seq id no：50所示(5端鉴定
‑
fw：5'
‑
ttcaaaacctctttactgccg)和5端鉴定的反向引物的核
苷酸序列如seq id no：51所示(5端鉴定
‑
rev：5'
‑
ggtctttcacatcttctgggc
‑
3')进行5’端同源臂扩增，用3端鉴定的正向引物的核苷酸序列如seq id no：52所示(3端鉴定
‑
fw：5'
‑
gatggctactcctcatgttgc
‑
3')和用3端鉴定的反向引物的核苷酸序列如seq id no：53所示(引物3端鉴定
‑
rev：5'
‑
cgccgtctctggtccattatt
‑
3')进行3’端同源臂扩增，确定同源臂单交换所发生的位置；(3)将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子，进行无抗传代培养，连续传代10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初步确定为基因整合成功；(4)提取初步确定基因整合成功的枯草芽孢杆菌的基因组，用引物5端鉴定
‑
fw和引物3端鉴定
‑
rev进行pcr扩增，对扩增产物进行测序，基因整合成功的枯草芽孢杆菌。最终获得5个基因整合成功的重组表达工程菌(分别命名为枯草芽孢杆菌bs16
‑
1、枯草芽孢杆菌bs16
‑
2、枯草芽孢杆菌bs16
‑
3、枯草芽孢杆菌bs16
‑
4和枯草芽孢杆菌bs16
‑
5)。
[0093]
采用实施列2的培养方法对这5个重组转化子进行培养筛选，培养48小时后，5个重组表达工程菌所对应的酶活为分别为2510u/ml，2515u/ml、2351u/ml、2462u/ml和2615u/ml。由于bs16
‑
5发酵酶活最高，因此选择重组表达工程菌bs16
‑
5进行高密度发酵培养。
[0094]
实施例6
[0095]
高密度发酵
[0096]
以重组表达工程菌种枯草芽孢杆菌bs16
‑
5进行高密度发酵实验，高密度发酵实验在7升和50升发酵罐进行，高密度发酵的培养基为：麦芽糖7％、豆粕2.5％、酵母粉1.5％、麸皮2％、磷酸氢二钾1％、柠檬酸三钠0.3％、氯化钙0.3％，培养温度为37℃，培养ph为6.0。培养过程中每隔一段时间取发酵液进行酶活测定。
[0097]
实验结果，如图3所示，重组表达工程菌种枯草芽孢杆菌bs16
‑
5在7升发酵罐培养48小时后发酵酶活力达到最高为51807u/ml。如由图4所示，在50升发酵罐培养48小时后发酵酶活最高为53708u/ml。
[0098]
实施例7
[0099]
温度特性测定
[0100]
将高密度发酵液离心，获得液体碱性蛋白酶bcp酶液，碱性蛋白酶bcp的温度特性测定如下：在ph10.0条件下测定碱性蛋白酶bcp在20℃～70℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100％，计算其他温度下的相对酶活；在50℃～70℃不同温度下水浴热处理10min后测定剩余酶活，以未热处理的酶活作为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。
[0101]
实验结果，碱性蛋白酶bcp的温度特性如图5所示，碱性蛋白酶bcp在20℃和70℃的相对酶活分别为9.7％和31.6％，最适反应温度为60℃，热稳定性方面碱性蛋白酶，bcp在20℃～50℃不同温度下具有良好的稳定性，热处理10min后，剩余酶活均大于90％，当温度提升至50℃以上，bcp热稳定性急剧下降，60℃和70℃热处理10min后剩余酶活仅为21％和3％。
[0102]
实施例8
[0103]
ph特性测定
[0104]
将高密度发酵液离心，获得液体碱性蛋白酶bcp酶液，碱性蛋白酶bcp的ph特性测定如下：在60℃条件下测定碱性蛋白酶bcp在ph6.0～11.0下的酶活，以测定酶活最高ph下的酶活为100％，计算其他ph下的相对酶活；在ph6.0～11.0条件下，室温保存5小时后测定
剩余酶活，以未做任何处理的酶活作为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。
[0105]
实验结果，碱性蛋白酶bcp的ph特性如图6所示，碱性蛋白酶bcp在ph7.0～11.0范围内相对酶活均大于70％，其最适反应ph为10.0；ph稳定性方面，在ph6.0～11.0条件下，室温保存5小时后剩余酶活均大于80％，表明在该ph范围内碱性蛋白酶bcp具有良好的稳定性。
[0106]
本发明中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译。第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明(氨基酸中英文名称及其缩写和代号见表4)。
[0107]
表4氨基酸中英文名称及其缩写和代号
[0108][0109]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。