一种鉴定水禽圆环病毒两种基因型的方法与流程

1.本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种鉴定水禽圆环病毒两种基因型的方法。


背景技术：

2.鸭圆环病毒(duck circovirus,ducv)是一种直径为15～16nm、无囊膜、二十面体对称，基因组约为1.9kb的单链环状dna病毒，属于圆环病毒科，圆环病毒属。ducv最早在2003年由德国的hattermann等首次报道，后相继在匈牙利、美国、韩国、中国台湾及中国大陆等地发现或报道。鸭子感染ducv后会出现羽毛混乱、生长迟缓、体重减轻等症状。依据ducv的基因组及cap基因的序列分析，目前将ducv分为两个基因型：ducv
‑
1和ducv
‑
2。目前已经建立了检测ducv的pcr、荧光定量pcr、核酸探针杂交以及elisa方法，并完成了流行病学调查。
3.目前圆环病毒普遍存在于鸭群中，且普遍存在ducv
‑
1和ducv
‑
2混合感染的情况，但对于ducv
‑
1和ducv
‑
2的鉴别还存在问题。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种鉴定水禽圆环病毒两种基因型的方法，从而弥补现有技术的不足。
5.本发明首先提供一种引物组，所述的引物组包含有1条上游引物和2条下游引物，其中上游引物的信息如下：
6.ducv
‑
f：5
′‑
gcacgctcgacaattgcaag
‑3′
(seq id no:1)，
7.下游引物的信息如下：
8.ducv
‑
r1：5
′‑
tgttaattctgcggtacaga
‑3′
(seq id no:2)，
9.ducv
‑
r2：5
′‑
agataatgcgaccggcgacg
‑3′
(seq id no:3)。
10.本发明所提供的引物组用于鉴定水禽圆环病毒两种基因型ducv
‑
1和ducv
‑
2；或是用于制备检测两种基因型ducv
‑
1和ducv
‑
2的制品；
11.本发明还提供一种检测水禽圆环病毒两种基因型ducv
‑
1和ducv
‑
2的方法，是利用上述引物组进行pcr扩增检测；
12.所述pcr反应体系包括：终浓度为1
×
的additive for high specificity，终浓度为1
×
的mightyamp buffer(mg
2+
,dntp)，浓度为1.25u/μl的mightyamp dna polymerase，引物混合物浓度为20μm。
13.pcr反应的条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸2min，32个循环，72℃延伸10min。
14.本发明的引物组合能特异地扩增出样品中的水禽圆环病毒的cap基因片段，检测灵敏度高，根据扩增基因片段的大小区分两种基因型，结果快速准确，极大地降低了时间成本和试剂成本。
附图说明
15.图1：多重引物特异性验证电泳图，其中m是dl2000 dna marker，1，ducv
‑
1基因型阳性样本；2，ducv
‑
1基因型阳性样本；3，gpv样本；4，eds样本；5，iltv样本；6，alv样本；7，mdv样本；8，fpv样本；9，mdpv样本；10，阴性对照；10，阴性对照。
16.图2：多重引物扩增ducv
‑
1基因型样本敏感性验证电泳图，其中m是dl2000 dna marker，1，ducv
‑
1核酸浓度为200ng/ul，2，ducv
‑
1核酸浓度为40ng/ul；3，ducv
‑
1核酸浓度为8ng/ul；4，ducv
‑
1核酸浓度为1.6ng/ul；5，ducv
‑
1核酸浓度为0.32ng/ul；6，ducv
‑
1核酸浓度为0.064ng/ul；7，ducv
‑
1核酸浓度为0.012ng/ul；8，ducv
‑
1核酸浓度为0.002ng/ul；9，ducv
‑
1核酸浓度为忽略不计；10，ducv
‑
1核酸浓度为忽略不计。
17.图3：多重引物扩增ducv
‑
2基因型样本敏感性验证电泳图，其中m是dl2000 dna marker，1，ducv
‑
2核酸浓度为200ng/ul，2，ducv
‑
2核酸浓度为40ng/ul；3，ducv
‑
2核酸浓度为8ng/ul；4，ducv
‑
2核酸浓度为1.6ng/ul；5，ducv
‑
2核酸浓度为0.32ng/ul；6，ducv
‑
2核酸浓度为0.064ng/ul；7，ducv
‑
2核酸浓度为0.012ng/ul；8，ducv
‑
2核酸浓度为0.002ng/ul；9，ducv
‑
2核酸浓度为忽略不计；10，ducv
‑
2核酸浓度为忽略不计。
18.图4：ducv
‑
1和ducv
‑
2基因型同源性分析图。
19.图5：实验室疑似水禽圆环病毒阳性样品基因型验证电泳图。
具体实施方式
20.本发明建立的圆环病毒1型和2型区分方法中，1型和2型仅通过单一目的条带即可有效区分。实施例中的阳性样品选用本实验室的水禽圆环病毒阳性病料，以其阳性病料样本为模板，阴性对照为spf鸭胚尿囊液；利用上述引物组进行pcr扩增，ducv
‑
1和ducv
‑
2基因型分别获得700bp和1080bp的pcr产物。序列分析表明扩增的dna片段均为相应的圆环病毒基因型序列。
21.下面结合具体实施例对本发明的引物组合使用方法进行详细说明。
22.实施例1：引物设计筛选及检测方法
23.1、引物设计
24.鸭圆环病毒基因组约为1.9kb的单链环状dna分子，ducv的基因组中已经确定的基因有3个，分别是位于正链的编码复制蛋白的orf1(也称rep基因)，位于互补链的编码衣壳蛋白的orf2(也称cap基因)，以及位于互补链的具有凋亡活性蛋白的orf3。依据ducv的基因组鸡cap基因的序列分析，将ducv分为ducv
‑
1和ducv
‑
2。两基因型的核苷酸同源性为82％～84％(图4)。根据两种基因型性的参考毒株ducv
‑
1(登录号ay228555、ef451157、eu022375、gu131340)、ducv
‑
2(登录号ay394721、dq166836、dq166837、ef370476)设计引物，在n端保守区设计一条通用上游引物，在c端碱基差异区设计扩增两种基因型的特异性引物。引物序列如下：
25.f：5
’‑
gcacgctcgacaattgcaag
‑3’
，
26.r1：5’tgttaattctgcggtacaga
‑‑3’
，
27.r2：5
’‑
agataatgcgaccggcgacg
‑3’
，
28.预期ducv
‑
1出现700bp的条带，ducv
‑
2出现1080bp的条带。
29.2、引物特异性和敏感性验证
30.①
引物特异性验证
31.用该多重引物对gpv、eds、iltv、alv、mdv、fpv、mdpv七种病毒基因组进行pcr检测，验证该多重引物的特异性。pcr产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，goldenview染色，在紫外线下观察，结果如图1所示,七种病毒扩增结果均为阴性。
32.②
引物敏感性验证
33.取ducv
‑
1、ducv
‑
2的阳性病料各10ul，分别进行5倍倍比稀释，使模板浓度为200ng/ul～0.002ng/ul，验证该引物的敏感性。结果如图2、3所示，该多重引物检出ducv
‑
1、ducv
‑
2的最小核酸浓度均为1.6ng/ul。
34.3、pcr反应(25ul体系)
35.0.5ul病料上清液中加入additive for high specificity 2.5ul，加入mightyamp buffer(mg2+,dntp)12.5ul，加入mightyamp dna polymerase0.5ul，20um引物混合物加入1.5ul。pcr反应的条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸2min，32个循环，72℃延伸10min。
36.pcr产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，goldenview染色，在紫外线下观察，结果如图1所示，不同血清型的dna样品在预期目标处出现明亮条带。
37.4、pcr产物测序验证
38.切胶回收pcr产物，将回收的pcr产物连接到t载体，送测序公司测序，经blast序列分析显示，700bp的目的基因条带为ducv
‑
1，其序列如seq id no:4所示；1080bp的目的基因条带为ducv
‑
2，其序列如seq id no:5所示。
39.实施例2，水禽圆环病毒感染病料基因型验证
40.对本实验室水禽圆环病毒疑似阳性病料共6份，每份取0.5ul病料上清液，加入additive for high specificity 2.5ul，加入mightyamp buffer(mg2+,dntp)12.5ul，加入mightyamp dna polymerase0.5ul，20um引物混合物加入2.5ul。pcr反应的条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸2min，32个循环，72℃延伸10min。pcr产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，goldenview染色，在紫外线下观察，结果如图5所示，其中5份样本的dna样品在780bp处出现明亮条带，均属于圆环病毒1型，1份阴性；结果表明本发明所提供的引物组和方法可以有效的检测水禽圆环病毒两种基因型。