一种基于qPCR检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用

一种基于qpcr检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用
技术领域
1.本发明属于病原检测技术领域，具体涉及一种基于qpcr检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用。


背景技术：

2.2014年，我国首次发现，因感染水貂星状病毒而出现脑炎症状(水貂震颤综合征)的水貂，该病毒的感染具有窝发传染性，这给水貂养殖业带来极大的危害。星状病毒是星状病毒科的一种无包膜、单链rna病毒，有较高的遗传多样性和重组潜能，由于在复制过程中其聚合酶没有校对功能，进而复制极易突变，因此该病毒的检测较为困难。
3.目前，水貂星状病毒的临床检测主要为普通pcr方法，国内尚未有该病毒实时荧光定量检测方法的相关专利，而实时荧光定量pcr检测技术是在普通pcr技术的基础上发展起来一种灵敏度高、特异性强、速度快的检测技术，对各类病原的检测具有更好的效果，因此，亟需一种用于检测水稻星状病毒的实时荧光定量pcr检测方法。


技术实现要素：

4.本发明为解决利用普通pcr方法检测水貂星状病毒灵敏度、特异性和速度不够的问题，提供一种基于qpcr检测水貂星状病毒的引物探针组及其应用，具体技术方案如下：
5.本发明的第一个目的是提供一种基于qpcr检测水貂星状病毒的引物探针组，所述引物探针组由上游引物、下游引物和探针组成，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。
6.在本发明的一种实施方式中，所述探针5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬火基团。
7.在本发明的一种实施方式中，所述报告基因为6
‑
羧基荧光素，所述荧光淬火基团为tamr
‑
n。
8.本发明的第二个目的是提供上述引物探针组在制备用于检测水貂星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
9.本发明的第三个目的是提供一种基于qpcr检测水貂星状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所述的上游引物、如seq id no.3示的下游引物和如seq id no.4所示的探针。
10.在本发明的一种实施方式中，利用所述试剂盒扩增目的基因的反应体系为：2
×
荧光定量pcr预混液10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，探针0.2μl，dna2μl，去离子水7.0μl。
11.在本发明的一种实施方式中，所述上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μm。
12.在本发明的一种实施方式中，利用所述试剂盒扩增目的基因的反应条件为95℃30s；95℃5s，60℃1min，40个循环。
13.本发明的有益效果：
14.本发明通过对不同宿主来源的星状病毒orfla基因的核苷酸序列进行比对，选取orfla基因的相对保守区，根据水貂星状病毒orfla基因，设计了基于实时荧光定量pcr的引物探针组。将该引物探针组应用于水貂星状病毒的检测中，并通过对荧光定量pcr反应体系和条件的优化，获得了最低检测量为6.274
×
104copies/μl的灵敏性、特异性、准确性、重复性和稳定性良好且快速的水貂星状病毒检测方法。
附图说明
15.图1为星状病毒的qpcr标准曲线；
16.图2为荧光定量pcr方法的灵敏性检测结果图；图中扩增曲线水貂星状病毒从左至右的浓度依次为6.274
×
10
10
copies/μl，6.274
×
109copies/μl，6.274
×
108copies/μl，6.274
×
107copies/μl，6.274
×
106copies/μl，6.274
×
105copies/μl，6.274
×
104copies/μl，6.274
×
103copies/μl；
17.图3为荧光定量pcr方法的特异性检测结果图；图中扩增曲线从左至右依次为水貂星状病毒(6.274
×
105copies/μl)、水貂星状病毒(6.274
×
104copies/μl)，犬瘟热病毒，犬细小病毒，水貂细小病毒。
具体实施方式
18.以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
19.本发明所用到的仪器为由roche公司生产的lightcycler 96荧光pcr仪
20.本发明所用的病毒rna提取试剂盒、rna反转录试剂盒、pcr预混液购自takara公司，引物探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
21.实施例1：一种基于qpcr检测水貂星状病毒的引物探针组
22.引物和探针的设计：
23.星状病毒基因组大小6.8kb，包含3个开放阅读框，编码非结构蛋白orfla，orflb和编码衣壳蛋白orf2，其中编码非结构蛋白orfla的基因大小为2.8kb以内，编码110kda的氨基酸，多肽包含多种保守基因序列，组成病毒的丝氨酸蛋白酶，编码病毒的非结构蛋白。对不同宿主来源的星状病毒(如人、猪和牛等)orfla基因的核苷酸序列比对，选取orfla基因的相对保守区，在astv的序列保守区设计引物和探针，参考序列的ncbi登录号为nc_004579。
24.上游引物序列如seq id no.1所示：5
’‑
gcttgaggtcttagccag
‑3’
或如seq id no.2所示：5
’‑
gcttgaggtcttagctag
‑3’
；
25.下游引物序列如seq id no.3所示：5
’‑
tccctccaaagtttatc
‑3’
；
26.探针序列如seq id no.4所示：5’fam
‑
cagtcgctccgtgacatggac
‑3’
tamr
‑
n。
27.利用上述引物探针组扩增出的序列如seq id no.5所示：
[0028]5’‑
cttgaggtcttagccaggcacatccgcaacttgggcggcgaggagcccgtccatgtcacggagcgactgcttgataaactttggagggga
‑3’
[0029]
实施例2：基于荧光定量pcr的检测水貂星状病毒的方法
[0030]
(1)以水貂的脑组织为检测样本，采用quagen rna提取试剂盒提取样品rna，后使用quagen rna反转录试剂盒将rna反转录为cdna。
[0031]
(2)用实施例1所述的引物探针组扩增orfla基因，反应体系为30μl，包括：pcr预混液(2
×
)15μl，上游引物1μl，下游引物1μl，探针1μl，去离子水10μl，dna2μl。反应条件为：94℃加热解链30s，然后52℃退火30s，72℃延伸30s，以上步骤共37个循环，再于72℃延伸10min。
[0032]
荧光定量pcr反应条件的优化：
[0033]
通过对反应体系中引物浓度、探针浓度和退火温度实验结果的比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型s型扩增荧光信号曲线、扩增效率接近1的反应体系。优化得到的反应体系为：荧光定量pcr预混液(2
×
)10μl，上游引物(10μm)0.4μl，下游引物(10μm)0.4μl，探针(10μm)0.2μl，dna2μl，去离子水7.0μl；优化得到的反应条件为：95℃30秒
→
(95℃5秒
→
60℃20秒)
×
40。
[0034]
对本发明所述检测水貂星状病毒方法的评价：
[0035]
1、计算优化后的荧光定量pcr反应条件对应的质粒拷贝数：
[0036]
①
以水貂的脑组织为检测样本，采用quagen rna提取试剂盒提取样品rna，后使用quagen rna反转录试剂盒将rna反转录为cdna。
[0037]
②
用实施例1所述的引物探针组扩增orfla基因，反应体系为30μl，包括：pcr预混液(2
×
)10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，探针0.2μl，去离子水7.0μl，dna2μl。反应条件为：95℃30秒
→
(95℃5秒
→
60℃20秒)
×
40。
[0038]
③
2.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，切胶，使用takara胶回收试剂盒回收目的片段，目的片段大小为497bp。用ta克隆试剂盒，将所扩增的目的基因克隆至pmd18
‑
t载体，转化至大肠杆菌dh5α株，筛选阳性克隆并进行pcr鉴定，鉴定为阳性的菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，将序验证正确的单克隆菌扩大培养。
[0039]
④
采用takara质粒提取试剂盒对菌液进行质粒的抽提与纯化，使用紫外分光光度计测定质粒浓度，质量浓度为192ng/ml，dna长度为2791，质粒拷贝数＝(6.02
×
10
23
)
×
(ng/μl
×
10
‑9)/(dnalength
×
660)＝6.274
×
1010copies/μl。
[0040]
2、荧光定量pcr标准曲线的建立：
[0041]
用去离子水将获得的定量标准质粒进行10倍倍比稀释，浓度为6.274
×
10
10
，6.274
×
109，6.274
×
108，6.274
×
107，6.274
×
106copies/μl，每个稀释度做三个重复。绘制标准曲线(如图1)，结果显示，本检测方法具有良好的线性关系，标准曲线的相关系数(r2)达到0.99。根据建立的标准曲线，荧光定量pcr在6.274
×
104‑
6.274
×
108拷贝copies/ul的稀释度范围内呈现良好的线性关系(见图1中标准曲线极值)。
[0042]
3、方法灵敏性评级
[0043]
用去离子水将定量标准质粒进行10倍倍比稀释，浓度分别为6.274
×
10
10
，6.274
×
109，6.274
×
108，6.274
×
107，6.274
×
106，6.274
×
105，6.274
×
104，6.274
×
103copies/μl，用最优化的体系和反应条件对本方法进行灵敏度检测，结果见图2。通过结果可以看出，荧光定量pcr的最低检测量为6.274
×
104copies/μl。
[0044]
4、方法特异性评价
[0045]
选择农业部经济动物疫病重点实验室病毒库中已有的细胞毒株犬瘟热病毒(cdv)，犬细小病毒(cpv)，水貂细小病毒(mev)、水貂星状病毒(6.274
×
105copies/μl)、水貂星状病毒(6.274
×
104copies/μl)和阴性对照应用本方法特异性检测，用最优化的体系和反应条件对本方法进行特异性检测，结果如图3所示。通过结果可看出，水貂可能携带的其他病原(cdv、cpv、mev)及阴性对照扩增的cq值均为无数值，可判定为阴性，本方法仅对水貂星状病毒的核酸有特异性扩增。图3中扩增曲线从左至右依次为水貂星状病毒(6.274
×
105copies/μl)、水貂星状病毒(6.274
×
104copies/μl)，犬瘟热病毒，犬细小病毒，水貂细小病毒。
[0046]
5、方法重复性及稳定性评价
[0047]
以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行批内和批间重复性试验，结果显示组内cq值变异系数(cv)为0.21％～3.38％，组间值cq值变异系数(cv)为2.76％～5.24％(见表1)。此结果表明所建立的水貂星状病毒荧光定量pcr检测方法具有良好的重复性，可进行稳定、可靠的检测。
[0048]
表1.荧光定量pcr的重复性和稳定性评价结果
[0049][0050]
6、临床样本检测
[0051]
分别采用普通pcr方法和荧光定量pcr方法对44份水貂脑组织样本进行检测，普通pcr方法水貂星状病毒的阳性检出率为36.36％(16/44)，而所建立的水貂星状病毒实时荧光定量方法阳性检出率为45.45％(20/44)。表明所建立的荧光定量pcr方法敏感性高于常规pcr。
[0052]
实施例3：一种基于qpcr检测水貂星状病毒的试剂盒
[0053]
一种基于qpcr检测水貂星状病毒的试剂盒包括核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所述的上游引物(10μm)、如seq id no.3所示的下游引物(10μm)和如seq id no.4所示的探针(10μm)。
[0054]
利用该试剂盒的检测水貂星状病毒的方法为：
[0055]
以水貂的脑组织dna为检测样本，用所述的上、下游引物和探针扩增orfla基因，反应体系为30μl，包括：pcr预混液(2
×
)10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，探针0.2μl，去离子水7μl，dna2μl。反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃20s，40个循环。