噬菌斑的培养和观察方法

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种噬菌斑的培养和观察方法。


背景技术：

2.噬菌体(phage)是感染细菌、放线菌及蓝细菌等原核生物的病毒，是遗传学、分子生物学和基因工程的常见实验材料，广泛存在于自然界的各个生境中。根据其侵染宿主后是否裂解宿主，可分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体会侵染宿主在菌苔上形成一个个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的形态，故可用作噬菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。
3.噬菌体的分离纯化是普通微生物学实验、病原微生物学实验和环境工程微生物学实验等课程的必做项目之一。噬菌斑的培养和观察，是本实验项目的核心技术。目前，国内外教材多沿用adams1959年发明的双层平板法，其主要步骤为:预先分别配制含2％和0.7％琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板,待凝固。再把预先融化并冷却到45℃的上层培养基混合较浓的敏感宿主和一定体积的噬菌体待检液，混匀后铺平在已凝固的底层平板上，如存在能裂解宿主菌的噬菌体，则培养一段时间后，出现肉眼可见的噬菌斑。该方法存在几个显著的缺点：
4.(1)使用预先融化的上层培养基混合宿主和噬菌体，温度很难把握。低于45℃，上层琼脂在混合过程中即凝固，高于60℃，则噬菌体有灭活的风险，所以初学者往往手忙脚乱，且上层琼脂很容易因凝固而出现琼脂块。
5.(2)肉眼观察难度大。虽然用底层培养基补平，避免了玻璃培养皿底部凹凸不平，但由于大肠杆菌菌落无色半透明，琼脂虽透明亦呈现淡黄色，仅凭肉眼观察，初学者很难辨识噬菌斑。
6.(3)培养基营养丰富，对实验环境和操作技术要求较高，很容易被环境中的其它微生物污染，干扰实验结果。
7.(4)观察时间苛刻。尽管多数教程规定培养后18
‑
24h观察。但实际上噬菌斑的最佳观察时间在培养的4
‑
20h之间，超过20h往往会出现斑块界限模糊，可能是因为上层培养基很软，方便宿主或污染的其它杂菌在琼脂表面运动。
8.此外，在噬菌斑培养前期的噬菌体增殖环节，教材多选用大容量污水(200ml)直接增殖噬菌体。该步骤有两个缺陷，一是实验材料体积较大，操作不便；二是污水中同时包含多种微生物，这些微生物均可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨液体培养基中增殖，因此，本步骤并没有选择性的增殖大肠杆菌噬菌体。
9.为了增加噬菌斑和背景的对比度，研究人员在上层琼脂中添加红四氮唑等染料，但染料对大肠杆菌的生长存在一定的抑制。或在培养后用2,3,5氯化三苯基四氮唑(ttc)染色，染色后倾去染料，染料被菌苔中的活细胞还原，从而使噬菌斑和菌苔呈现鲜明对比。然而上层琼脂软(0.7％)，硬度低，且大肠杆菌菌落与培养基结合不紧密，染色过程中很容易将菌苔冲起或将上层培养基破坏，进而也无法观察和计数噬菌斑。


技术实现要素：

10.本发明为一种改良的噬菌斑培养和观察方法，在双层平板法的基础上，将底层琼脂改成无营养物的水琼脂，同时将双层平板改成三层，即两层水琼脂中间夹一层半固体琼脂，将宿主菌和噬菌体局限在中间层，这样既降低了环境中微生物在平板上定殖的风险，也使形成的噬菌斑都接近于同一平面上，避免了噬菌斑的上下重叠。培养完毕，洗去表层水琼脂上污染的其它杂菌，用低浓度亚甲基蓝染色后可清晰的观察到噬菌斑，噬菌斑的大小接近、边缘清晰，无上下噬菌斑的重叠现象。发明包括以下步骤：
11.步骤1：水样预检，选择总大肠菌群阳性的环境水样为噬菌体分离培养材料。
12.步骤2：制备菌悬液，无菌操作从伊红美兰培养基上挑取选择一个深紫红色、有金属光泽的菌落的单菌落，接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃，150rpm培养1～3hour。
13.步骤3：水样处理与增殖噬菌体，取污水2ml，4℃，10000rpm离心1min，收集上清，上清中加0.2ml氯仿涡旋1min，静置，收集上层液体1ml添加于5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，同时添加0.2ml大肠杆菌的菌悬液，37℃，150rpm过夜培养以增殖噬菌体。
14.步骤4：噬菌体增殖液的稀释，取2ml噬菌体增殖液4℃，10000rpm离心1min收集上清液，上清加0.2ml氯仿涡旋震荡1min，静置，上层液体为富集的噬菌体样品。用1％蛋白胨水将富集的噬菌体样品10倍倍比稀释到10
‑3～10
‑7。
15.步骤5：噬菌体、宿主混合液的制备，在制备好的噬菌体梯度稀释液中添加大肠杆菌悬液，添加比例为每1ml稀释液添加50μl菌悬液，颠倒混匀。
16.步骤6：夹层平板法培养噬菌斑，在无菌平皿中加入约5ml水琼脂，冷却待凝固。再在将混匀的宿主
‑
噬菌体混合液倾倒在已经凝固的底层平板上，随即倾入一层保温的半固体培养基，混匀，每皿约10ml，静置待凝。最后，再倒入一层保温的水琼脂，每皿约10ml，凝固后倒置37℃培养过夜。
17.步骤7：染色观察噬菌斑，缓缓用流水清洗夹层平板表面，去除表面污染的杂菌和灰尘，吸干残水后用0.05％亚甲基兰水溶液染色2min，倾去染液，观察，背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈现不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色圆形空斑。
18.本发明亦可用于其它噬菌体形成噬菌斑的培养与观察，但相关步骤需要做适当调整。
19.本发明的有益效果为：
20.(1)增加了水样预检环节。由于噬菌体通常和其宿主共存在于特定生境中，而大肠杆菌是总大肠菌群的重要组成，如水样总大肠菌群检测阳性，则说明水体中存在大肠杆菌，水体也存在大肠杆菌的噬菌体。此外如实验室无适合的大肠杆菌菌株，可利用本步骤同时分离环境大肠杆菌菌株，针对水体中大肠杆菌分离特定的噬菌体。但如采用大肠杆菌的工程菌，如dh5α、bl21和jm109等，则不一定能保证实验成功。
21.(2)宿主菌始终保持在伊红美兰培养基上传代。由于伊红美兰培养基为一种鉴别培养基，大肠杆菌在上面呈现独特的菌落特征，即深紫红色、有金属光泽、表面比较湿润的光滑菌落，至少保证了宿主的菌落纯，避免制备的菌悬液含有其它杂菌。
22.(3)选择性增殖水体中的噬菌体。传统方法使用大剂量(200ml)污水直接增殖噬菌体，消耗试剂多，操作强度大。此外，由于牛肉膏蛋白胨液体培养基营养丰富，污水中的许多微生物都能在其中生长，因此选择性不强。本方法使用小剂量(2ml)污水，同时通过高速离
心和氯仿处理去除污水中的细胞，仅使用污水中的非细胞成分增殖噬菌体，增强了实验的选择性。
23.(4)避免了操作过程中半固体培养基的凝固。传统方法中噬菌体梯度稀释液制备后，要在半固体培养基中混合宿主菌和噬菌体稀释液，操作时要求准确迅速，否则上层琼脂很容易出现琼脂块，干扰后期观察。本发明采用浇注平板法，首先在1％蛋白胨水中混合宿主菌和噬菌体稀释液，混合液直接倾倒在已凝固的底层培养基上，然后再倒入保温的半固体培养基，混合，静置待凝，操作简便，避免了混合过程中培养基的凝固。
24.(5)使用夹层平板将宿主菌和噬菌体限制在培养皿的中间层，通过培养可在中间层形成噬菌斑，从而避免了噬菌斑的上下层重叠。此外，底层和表层都为2％的水琼脂，即使是操作过程中有环境微生物污染，由于水琼脂不含营养物，不能支持大多数微生物的生长，从而降低了污染的风险。表层的水琼脂也对形成的菌苔和噬菌斑起到保护层的作用，防止了后期染色过程中因滴加染色液强度大破坏菌苔。
25.(6)使用0.05％亚甲基兰水溶液对夹层平板进行染色，增加噬菌斑和菌苔的对比度，可清晰的观察到噬菌斑。背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈现不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色空斑。此外，由于亚甲基兰是一种活体染色剂，无毒无害，不影响后续实验。即可从形成的噬菌斑中继续分离噬菌体，进行后续实验。
26.(7)观察时间宽泛。双层平板法噬菌斑的最佳观察时间很短，超过20h会出现噬菌斑溶源化或耐受菌覆盖噬菌斑。这是因为上层培养基很软，宿主菌在琼脂表面运动会改变噬菌斑的形状。同时，污染的耐受菌也会破坏噬菌斑的形状。本方法培养24h和48h后观察，肉眼观察噬菌斑大小、分布和形态等特征并无显著不同，可能是因为大肠杆菌的运动被表层较硬的水琼脂限制，同时水琼脂也避免了杂菌的生长。这就极大程度上方便学生可在课余时间观察实验结果，开展后续实验。
附图说明
27.图1为夹层平板法示意图，从下到上依次为水琼脂、牛肉膏蛋白胨半固体培养基和水琼脂。
28.图2为分离的典型大肠杆菌菌落。
29.图3为观察到的大肠杆菌噬菌斑。
具体实施方式
30.1.实验材料
31.1.1培养基及试剂
32.①
乳糖蛋白胨液体培养基
33.蛋白胨10g,牛肉膏3g，乳糖5g，nacl 5g，16g/l的溴甲酚紫乙醇液1.0ml，蒸馏水1000ml，ph 7.2～7.4，分装试管，每管5ml，内放小倒管一只115℃灭菌30min。
34.②
伊红
‑
美蓝培养基(emb)培养基
35.蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂18～20g，蒸馏水1000ml，ph 7.2～7.4，115℃灭菌30min，冷却后添加20g/l的伊红水溶液20ml，5g/l美蓝水溶液13ml，混匀，倒平板，凝固后4℃冰箱保存备用。
36.③
牛肉膏蛋白胨液体培养基
37.牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl 5g，cacl
2 10mm，水1 000ml，ph 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
38.④
水琼脂
39.琼脂18～20g，水1 000ml，121℃灭菌20min。
40.⑤
牛肉膏蛋白胨半固体培养基
41.牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl 5g，cacl
2 10mm，琼脂10～12g，水1 000ml，ph 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
42.⑥
蛋白胨水
43.蛋白胨10g，cacl
2 10mm，水1000ml，ph 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
44.⑦
0.05％亚甲基蓝水溶液
45.亚甲基兰0.05g，水100ml。
46.⑧
氯仿
47.⑨
革兰氏染色液一套
48.1.2材料：
49.环境水样、培养皿、试管、离心管、枪头
50.1.3菌种：大肠杆菌
51.如实验室无保存的大肠杆菌菌株，也可利用水样预检时进行分离纯化，获得大肠杆菌。
52.2.仪器设备
53.超净台、摇床、培养箱、水浴锅、显微镜、离心机、涡旋振荡器、移液器、酒精灯、接种环、离心管架、试管架。
54.3.实施步骤
55.day 1：
56.1.准备培养基和材料：乳糖蛋白胨水液体培养基，10管，每管5ml。
57.2.采集水样：选择有可能被人畜粪便污染的水体为研究对象。
58.3.水样预检：初发酵，以无菌操作向乳糖蛋白胨液体培养基内注入10、1和0.1ml水样，每样做三个重复，同时做一个空白对照，混匀后置37℃静置过夜培养。产酸产气者为阳性。阴性者继续培养24h
±
3h再行检查。
59.day 2：
60.1.准备培养基和材料：伊红美兰平板，若干。
61.2.观察乳糖蛋白胨水是否产酸产气，如无，换水样重复day 1的工作，如有，进行后续工作。
62.3.平板分离实验：轻摇初发酵试验阳性管，用接种环以无菌操作取上述阳性管的培养物，在伊红美兰平板上划线接种，平板倒置于37℃温箱培养18～24h，每个阳性管划线接种一个伊红美兰平板。
63.day 3：
64.1.准备培养基和材料：乳糖蛋白胨水,若干，每管5ml。伊红美兰平板，2板；革兰氏染色液，1套。
65.2.观察伊红美兰平板实验结果，如有呈深紫红色、有金属光泽的菌落(图1)，为典型大肠菌菌落，同时在伊红美兰平板上进一步划线分离。
66.3.取典型菌落的部分培养物作涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌。
67.4.复发酵试验：无菌操作取该菌落的另一部分培养物再接种于乳糖蛋白胨发酵管内，同时做一个空白对照，37℃静置培养24h。
68.day 4：
69.1.准备培养基和材料：牛肉膏蛋白胨液体培养基，每管5ml，2管；氯仿；离心管若干。
70.2.观察复发酵的乳糖蛋白胨水是否产酸产气。如产酸产气，同时革兰染色为阴性无芽孢杆菌，则证实水体中存在总大肠菌群，即有较高的成功概率分离到大肠杆菌的噬菌体。同时可结合革兰氏染色、生理生化特征和菌落特征推测分离的菌株为大肠杆菌，该菌株可用于后续噬菌体培养，但如想一步明确其分类地位，需要补充相关实验。
71.3.制备菌悬液：无菌操作从伊红美兰平板上取1个单菌落接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃ 150rpm培养约1～3hour。
72.4.处理水样：取污水样品2ml，10000rpm离心1min，取上清液加入0.2ml氯仿涡旋1min，静置，上清为水体中噬菌体原样品。
73.5.增殖培养：于5ml肉膏蛋白胨液体培养基中，加入制备的噬菌体原样品1ml，大肠杆菌菌悬液0.2ml，37℃150rpm振荡过夜培养。
74.day 5:
75.1.准备培养基及材料：水琼脂500ml，灭菌后保温于50℃水浴锅中；牛肉膏蛋白胨半固体培养基400ml，灭菌后保温于50℃水浴锅中；1％蛋白胨水100ml；氯仿。无菌离心管、培养皿等。
76.2.制备菌悬液，无菌操作从伊红美兰平板上取1个单菌落接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃培养1～3hour。
77.3.制备底层平板：准备无菌平板，每皿加入约5ml水琼脂，冷却待凝固。
78.4.制备裂解液：取2ml前述噬菌体增殖液，10000rpm离心1min收集上清液，上清加0.2ml氯仿涡旋处理1min，静置，上层液体为富集的噬菌体样品。
79.5.裂解液稀释：取2ml离心管若干个，每管加入0.9ml蛋白胨水，用1％的蛋白胨水将富集的噬菌体样品10倍倍比稀释到10
‑3～10
‑7。
80.6.混合宿主菌：选择10
‑3～10
‑7稀释梯度噬菌体裂解液混合宿主菌，混合比例为每1ml噬菌体稀释液加入50μl制备的宿主菌菌悬液，颠倒混匀。
81.7.制备夹层平板：将混匀的宿主
‑
噬菌体混合液倾倒在已经凝固的底层平板上，随即倾入一层保温的牛肉膏蛋白胨半固体培养基，混匀，每皿约10ml，待凝固后，上层再倒入一层保温的水琼脂，每皿约10ml，待凝固。
82.8.培养：待夹层平板彻底凝固后，倒置37℃培养过夜。
83.day 6：
84.1.准备试剂：0.05％亚甲基蓝水溶液。
85.2.平板清洗：取出培养的夹层平板，缓缓用流水洗去表面污染的杂菌，用吸水纸吸干残水。
86.3.染色：用0.05％的亚甲基蓝水溶液覆盖平板表面，染色2min，每皿约需10～20ml染色液。
87.4.观察：倾去染液，吸水纸吸去残水，观察噬菌斑。背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈现不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色空斑。
88.备注：如实验室有大肠杆菌环境菌株，且确信水样总大肠菌群阳性，可直接从day 4工作2开始，实验前后历时3天。