1.本发明涉及环二肽类化合物制备，具体为一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法。
背景技术：
2.蛋白质可由酸、碱或酶水解，在水解过程中蛋白质逐步降解成为蛋白胨、多肽、三肽和二肽等越来越小的蛋白质碎片，直到最后成为氨基酸混合物。
3.在体内二肽通常能被二肽酶所水解而成为两个游离氨基酸。在体内肠黏膜细胞上也存在着吸收二肽或三肽的耗能主动运转体系，故有二肽吸收入细胞先于游离氨基酸之说。
4.二肽是一种化合物，是天然氨基酸即阿尔法氨基酸(氨基连在连有羧基的碳上)中的氨基于羧基脱水缩合而成的。其中只含一个肽键即
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co
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nh
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。可水解。
5.环二肽本质
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氨基酸肽键形成的化合物活性肽，与动物营养、荷尔蒙、酵素抑制、调节免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化作用直接。
6.现在环二肽类化合物类化合物制备不便，产量难以提升，同时制备方法繁琐。
技术实现要素：
7.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法，有效的解决了现在环二肽类化合物类化合物制备不便，产量难以提升，同时制备方法繁琐的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明包括如下步骤，1）将一株海洋假单胞菌即f
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q127菌种从固体斜面培养基中取适量接种到内装100ml液体培养基的三角瓶中，在28℃、180r
·
min－1的条件下摇床培养48h，作为种子培养液；2）将该种子培养液按体积分数7%的接种量接种于含150ml液体培养基的三角瓶中，共接种15l，在28℃180r
·
min－1的条件下摇床培养5d，再对培养液进行萃取，得到菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物；经薄层检查，菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物主要斑点相似，将两部分的氯仿萃取物合并得氯仿萃取物；3）对氯仿萃取物采用流式细胞术测定化合物的细胞周期抑制活性，得到环二肽类化合物。
9.有益效果：通过本发明的制备方法，由一株海洋假单胞菌可产出高含量的环二肽类化合物，分别鉴定为环(丙
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亮)［cyclo(ala
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leu)，1］、环(丙
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异亮)［cyclo(ala
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ile)，2］、环(丙
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缬)［cyclo(ala
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val)，3］、环(苯丙
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亮)［cyclo(phe
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leu)，4］、环(丙
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脯)［cyclo(ala
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pro)，5］和环(苯丙
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缬)［cyclo(phe
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val)，通过不同诱导时机目的蛋白的表达实验方法得到：海洋假单胞菌f
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q127生长5h时加入终浓度0.3mmol/l的诱导剂iptg诱导4h,为目的蛋白表达的最优条件。
具体实施方式
10.下面对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。
11.实施例，本发明提供一株海洋假单胞菌产出高含量环二肽类化合物方法，包括如下步骤，1）将一株海洋假单胞菌即f
‑
q127菌种从固体斜面培养基中取适量接种到内装100ml液体培养基的三角瓶中，在28℃、180r
·
min－1的条件下摇床培养48h，作为种子培养液；2）将该种子培养液按体积分数7%的接种量接种于含150ml液体培养基的三角瓶中，共接种15l，在28℃180r
·
min－1的条件下摇床培养5d，再对培养液进行萃取，得到菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物；经薄层检查，菌种发酵液的氯仿萃取物和菌丝体的氯仿萃取物主要斑点相似，将两部分的氯仿萃取物合并得氯仿萃取物。
12.3）对氯仿萃取物采用流式细胞术测定化合物的细胞周期抑制活性，得到环二肽类化合物，即从氯仿提取物中分离得到6个环二肽类化合物，分别鉴定为环(丙
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亮)［cyclo(ala
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leu)，1］、环(丙
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异亮)［cyclo(ala
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ile)，2］、环(丙
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缬)［cyclo(ala
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val)，3］、环(苯丙
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亮)［cyclo(phe
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leu)，4］、环(丙
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脯)［cyclo(ala
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pro)，5］和环(苯丙
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缬)［cyclo(phe
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val)。
13.对一株海洋假单胞菌培养的代谢物进行鉴定：得到化合物1：白色无定型粉末，正离子tof
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ms在m/z185处给出伪分子离子峰［m+h］+峰，与分子式c9h
16
o2n2相符，红外光谱在3193cm－1(m)和1689cm－1(s)处有吸收峰，示有酰亚胺基团，1h
‑
nmｒ(600mhz，cd3od)谱给出δ:3.99(1h，qd，j=6.2、0.8hz，h
‑
6)、3.93(1h，ddd，j=8.5、4.8、0.8hz，h
‑
3)、1.84(1h，m，h
‑
8)、1.72(1h，m，h
‑
7)、1.63(1h，m，h
‑
7)、1.44(3h，d，j=7.0hz，h
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11)、0.97(3h，d，j=6.6hz，h
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9)和0.95(3h，d，j=6.6hz，h
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10)质子信号，鉴定为环(丙
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亮)化合物；还可采用如下方法制备：取活化的种子菌,以1:100的接种量分别接种于10只5ml含氨苄青霉素lb液体培养基的试管中,37℃、200r/min摇床培养,每隔1h取出一只试管,紫外分光光度计测定od590值，同时以同样的方法培养e.colitb1和pmal
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c2x
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tb1菌株做对照，即可得到环二肽类化合物。
14.实验例海洋假单胞菌f
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q127目的蛋白表达条件的优化生长的实验方法，海洋假单胞菌f
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q127在不同的培养基中生长速率不同,将鉴定正确的转化菌分别接种于tb、gs选择培养基中(均含有100ug/ml氨苄青霉素,0.2%(w/v)葡萄糖),通过紫外分光光度计测定该菌在相同的时间内,在不同的培养基中的生长情况(以od表示),绘制生长曲线，不同诱导时机目的蛋白的表达，根据结果,分别取活化的种子菌以1:100的接种量接种于5只5ml含氨苄青霉素lb液体培养基的试管中,37℃、200r/min摇床培养,分别在工程菌延迟期(0.5h)、对数期(2h、3h、4h、5h)加入诱导剂iptg(终浓度为0.3mmol/l),继续震荡4h,取1ml菌液,sds
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page电泳；结果显示：海洋假单胞菌f
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q127生长5h时加入终浓度0.3mmol/l的诱导剂iptg诱导4h,为目的蛋白表达的最优条件。
15.有益效果：通过本发明的制备方法，由一株海洋假单胞菌可产出高含量的环二肽类化合物，分别鉴定为环(丙
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亮)［cyclo(ala
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leu)，1］、环(丙
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异亮)［cyclo(ala
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ile)，2］、环(丙
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缬)［cyclo(ala
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val)，3］、环(苯丙
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亮)［cyclo(phe
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leu)，4］、环(丙
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脯)［cyclo(ala
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pro)，5］和环(苯丙
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缬)［cyclo(phe
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val)，通过不同诱导时机目的蛋白的表达实验方
法得到：海洋假单胞菌f
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q127生长5h时加入终浓度0.3mmol/l的诱导剂iptg诱导4h,为目的蛋白表达的最优条件。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。