小分子肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种小分子肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肠是动物的主要消化吸收器官，其通过肠上皮细胞吸收营养物质。作为体内更新最快的一类细胞，肠上皮细胞是肠道内外环境的媒介，又是机体免疫屏障的重要组成部分，具有消化、吸收、分泌等生物学功能。肠上皮细胞起源于肠上皮干细胞的分化，肠上皮干细胞位于陷窝基底部，是一类具有自我更新、高度增殖、不对称性分裂和多向分化潜能的细胞。肠上皮干细胞的分化是一个连续的过程，每4～5天的周期内不断被更新，由陷窝底部起始，向肠腔内移行、分化、衰老直至凋亡脱落。小肠是食物消化和吸收的主要场所，由单层柱状上皮细胞覆盖的绒毛和肠腺组成。绒毛为肠上皮和固有层向肠腔内突出形成的细小突起，主要由吸收细胞和杯状细胞构成。吸收细胞数量较多，位于细胞基部，其顶端有微绒毛，集在一起形成“纹状缘”。杯状细胞是一种典型的糖蛋白分泌细胞，内含大量泡状和电子密度不一的粘液颗粒，有润滑和保护小肠黏膜的作用。肠腺又称为肠隐窝，为相对独立的发育单位，可调控肠上皮的更新，主要由吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞、未分化细胞及内分泌细胞构成。潘氏细胞分布于肠腺底部，其胞质丁部有嗜酸性颗粒，含有多种参与消化的酶。未分化细胞位于肠腺基部，为肠上皮的干细胞，可分化为多种不同类型的肠上皮细胞。
3.肠上皮细胞是肠道内主要的功能细胞，参与肠道食物的消化、吸收及内外分泌，构成体内的免疫屏障，调控体内免疫水平，并阻止微生物及毒素对肠道的侵袭。在分子水平上，肠上皮细胞分为可吸收的上皮细胞和不可吸收的上皮细胞。可吸收的上皮细胞位于小肠上部隐窝，不可吸收的上皮细胞位于绒毛中部。可吸收的上皮细胞主要参与食物的消化与吸收，如小肠微绒毛表面含有双糖酶、肽酶等，可促进糖和蛋白质的消化吸收。氨基酸、葡萄糖、乳糜微粒、长链脂肪酸等物质可通过位于绒毛内的中央乳糜管及其周围的毛细血管吸收进入血液。杯状细胞分泌粘液，润滑和保护肠上皮黏膜。分泌细胞则可分泌血清素、nt、pyy、p物质等神经肽及胺类激素，并以旁分泌形式调节胃肠运动及腺体分泌等功能。小肠刷状缘含有22中消化酶和19个参与氨基酸、脂酸、碳水化合物、维生素摄取与转运的系统。不可吸收的上皮细胞主要构成肠道内的屏障，参与机体的免疫，如黏膜肥大细胞可释放组织胺、血清素、蛋白酶等，其有助于血清抗体及补体进入肠腔，并清楚肠道内寄生虫及异物等。
4.可见，肠上皮细胞是保护人体的一道重要的屏障，而肠上皮细胞的损伤及后续引发的屏障功能的损坏都会引起炎症反应，最终导致相关疾病的发生。近年来，肠上皮细胞损伤相关疾病的患病概率增加，对于相关药物的需求也逐渐增大。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种能够减轻肠上皮细胞损伤和炎症反应的小分子肽。
6.本发明提供了一种小分子肽，其通式为x
‑
p
‑
y；其中，所述p的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述x不存在或为leu
‑
gln，所述y不存在或为ile
‑
pro。
7.在其中一个实施例中，所述小分子肽的氨基酸序列如seq id no：1或seq id no：2所示。
8.本发明还提供了一种核酸分子，其编码如上所述的小分子肽，或与编码如上所述的小分子肽的核苷酸序列反向互补。
9.本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的核酸分子的核苷酸序列。
10.本发明还提供了一种宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸分子。
11.如上所述的小分子肽、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于治疗肠上皮细胞损伤相关疾病的药物中的应用。
12.在其中一个实施例中，所述肠上皮细胞损伤相关疾病包括小肠结肠炎。
13.本发明还提供了一种用于治疗肠上皮细胞炎症相关疾病的药物，包括如上所述的小分子肽，以及药学上可接受的辅料。
14.在其中一个实施例中，所述辅料包括稀释剂、防腐剂、缓冲剂、崩解剂、抗氧剂、助悬剂、着色剂和赋形剂中的一种或多种。
15.本发明还提供了一种如上所述的小分子肽的制备方法，人工合成所述小分子肽，或使用权利要求5所述的宿主细胞进行基因表达获得所述小分子肽。
16.本发明筛选构建了一个小分子肽，其通式为x
‑
p
‑
y，其中p的氨基酸序列如seq id no：1所示，x不存在或为leu
‑
gln，y不存在或为ile
‑
pro。通过体内实验与体外实验证明，该小分子肽可调节肠上皮细胞凋亡和增殖，还可以减轻肠绒毛结构损伤、炎症细胞浸润，降低炎症因子水平，从而可以用于治疗肠上皮细胞损伤相关疾病，例如可用于改善坏死性小肠结肠炎(nec)等。
附图说明
17.图1为实施例1中各组细胞的凋亡检测结果，证明a肽和b肽都可不同程度降低lps诱导的细胞凋亡，而b肽效果最为显著；
18.图2为实施例1中各组细胞的增殖能力检测结果，证明a肽和b肽都可不同程度使fhc细胞的增殖能力恢复；
19.图3为实施例1中各组细胞的tnf
‑
α、il
‑
6表达水平检测结果，证明a肽和b肽均可不同程度降低nec模型细胞中tnf
‑
α、il
‑
6的表达水平，表明肠上皮细胞炎症得到缓解；
20.图4为实施例2中各组大鼠的肠组织he染色结果，证明小分子肽能够明显减轻肠绒毛结构损伤和炎症细胞浸润；
21.图5为实施例2中各组大鼠的肠组织病理评分结果；
22.图6为实施例2中各组大鼠的tnf
‑
α、il
‑
6表达水平检测结果，证明a肽和b肽均可以显著降低nec大鼠血清中tnf
‑
α、il
‑
6的表达水平。
具体实施方式
23.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
24.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
25.相关术语
[0026]“小分子肽”是介于氨基酸与蛋白质之间的一种生化物质，它比蛋白质分子量小，比氨基酸分子量大。小分子肽结构简单、分子量小，可快速透过小肠黏膜吸收而不需要再次消化，也不需要耗费能量，具有100％吸收的特点。小分子肽可以透过皮肤屏障、血脑屏障、胎盘屏障、肠胃黏膜屏障直接进入细胞内。因此，小分子肽的吸收、转化和利用是高效和完全的。
[0027]“载体(vector)”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。
[0028]“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞、hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。
[0029]
本发明一实施例的小分子肽，其通式为x
‑
p
‑
y；其中，p的氨基酸序列如seq id no：1所示，x不存在或为leu
‑
gln，y不存在或为ile
‑
pro。
[0030]
本发明筛选构建到的上述小分子肽，通过体内实验与体外实验证明，可以调节肠上皮细胞凋亡和增殖，还可以减轻肠绒毛结构损伤、炎症细胞浸润，降低炎症因子水平，从而可以用于治疗肠上皮细胞损伤相关疾病，例如可用于改善坏死性小肠结肠炎(nec)等。
[0031]
在其中一个实施例中，上述小分子肽的氨基酸序列如seq id no：1(pro
‑
leu
‑
met
‑
gln
‑
gln
‑
val
‑
pro
‑
gln
‑
pro)所示，该小分子肽包含9个氨基酸，分子量为1036.53，等电点为6.06。
[0032]
在其中一个实施例中，上述小分子肽的氨基酸序列如seq id no：2(leu
‑
gln
‑
pro
‑
leu
‑
met
‑
gln
‑
gln
‑
val
‑
pro
‑
gln
‑
pro
‑
ile
‑
pro)所示，该小分子肽包含13个氨基酸，分子量为1487.82，等电点为6.06。
[0033]
可选地，上述小分子肽的氨基酸序列也可以是seq id no：3(leu
‑
gln
‑
pro
‑
leu
‑
met
‑
gln
‑
gln
‑
val
‑
pro
‑
gln
‑
pro)或seq id no：4(pro
‑
leu
‑
met
‑
gln
‑
gln
‑
val
‑
pro
‑
gln
‑
pro
‑
ile
‑
pro)。
[0034]
本发明一实施例的核酸分子，其编码如上所述的小分子肽即编码链，或与编码如上所述的小分子肽的核苷酸序列反向互补即反义链。
[0035]
可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一小分子肽的核酸序列具有多种形
式，相关领域技术人员可以通过密码子表确定核酸序列，并进一步进行密码子优化，提高表达效率等。
[0036]
本发明一实施例的重组载体，其含有如上所述的核酸分子的核苷酸序列。
[0037]
可选地，重组载体基于原核细胞表达载体或真核细胞表达载体构建得到，原核细胞表达载体如pbad载体、pcal
‑
n/pcal
‑
pelb载体、ppow3.0表达载体等，真核细胞表达载体如pcmvp
‑
neo
‑
ban载体、pegfp表达载体、pegfp
‑
actin表达载体、psv2表达载体、cmv4表达载体等。但载体的类型并不限于此，可根据具体需要进行选择。
[0038]
可以理解，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。
[0039]
本发明一实施例的宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸分子。
[0040]
可以理解，如上所述的小分子肽、核酸分子、重组载体或宿主细胞均可应用于制备治疗肠上皮细胞损伤相关疾病的产品。
[0041]
可选地，上述肠上皮细胞损伤相关疾病包括小肠结肠炎。可以理解，由于上述小分子肽可以调节肠上皮细胞凋亡和增殖，还可以减轻肠绒毛结构损伤、炎症细胞浸润，降低炎症因子水平，因此其对于其他肠上皮细胞损伤相关疾病均有一定治疗作用。
[0042]
本发明一实施例的上述小分子肽的制备方法，可以人工合成该小分子肽，也可以使用上述宿主细胞进行基因表达获得该小分子肽。
[0043]
在一个具体示例中，制备方法包括以下步骤：在适宜的条件下培养上述宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到上述小分子肽。
[0044]
本发明一实施例的用于治疗肠上皮细胞炎症相关疾病的药物，其包括上述小分子肽，以及药学上可接受的辅料。
[0045]
在一个具体示例中，辅料包括稀释剂、防腐剂、缓冲剂、崩解剂、抗氧剂、助悬剂、着色剂和赋形剂中的一种或多种。
[0046]
在一个具体示例中，稀释剂选自聚乙二醇、丙二醇、植物油和矿物油中的一种或多种。在一个具体示例中，防腐剂选自山梨酸、山梨酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸苄酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯甲酸和苯甲醇中的一种或多种。在一个具体示例中，缓冲剂选自磷酸氢钠、磷酸二氢钠、枸橼酸钠、酒石酸钠和醋酸钠中的一种或多种。在一个具体示例中，崩解剂选自交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种。在一个具体示例中，抗氧剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、二丁基羟基甲苯、甘氨酸、肌醇、抗坏血酸、抗坏血酸钠、卵磷脂、苹果酸、氢醌、枸橼酸、琥珀酸和焦亚硫酸钠中的一种或多种。在一个具体示例中，助悬剂选自蜂蜡、乙基羟乙基纤维素、甲壳素、甲壳糖、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂、羟丙基甲基纤维素和黄原胶中的一种或多种。在一个具体示例中，着色剂选自炭黑、铁黑、铁棕、铁红和二氧化钛中的一种或多种。在一个具体示例中，赋形剂选自甘露醇、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、右旋糖苷和氯化钠中的一种或多种。
[0047]
下面将结合具体实施例和附图对本发明的实施方案进行详细描述。
[0048]
实施例1小分子肽对nec模型肠上皮细胞的影响
[0049]
1.实验材料
[0050]
fhc细胞：fetal human colon epithelial cell，人肠上皮细胞，购自atcc公司
(crl
‑
1831)。
[0051]
2.实验分组
[0052]
设置control组(con组)、nec组、nec+a肽(seq id no：1)及nec+b肽(seq id no：2)组。
[0053]
3.实验方法
[0054]
3.1 nec细胞模型构建
[0055]
培养至生长密度为80％～90％的fhc细胞，加入lps(100μg/ml)诱导，实验组，需提前1小时加入小分子肽预处理后再加入lps诱导。
[0056]
3.2细胞凋亡实验
[0057]
(1)贴壁细胞染色：使用不含edta的胰酶消化后，300g，4℃离心5min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性；
[0058]
(2)用预冷的pbs洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min，收集(1～5)
×
105细胞；
[0059]
(3)吸弃pbs，加入100μl 1
×
binding buffer重悬细胞；
[0060]
(4)加入5μl annexin v
‑
fitc和10μl pi staining solution，轻轻混匀；
[0061]
(5)避光、室温反应15min；
[0062]
(6)加入400μl 1
×
binding buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测；
[0063]
(7)样品分析：fitc最大激发波长为488nm，最大发射波长525nm，fitc的绿色荧光在fl1通道检测；pi
‑
dna复合物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm，pi的红色荧光在fl2或fl3通道检测。用cellquest等软件进行分析，绘制双色散点图(two
‑
color dot plot)，fitc为横坐标，pi为纵坐标。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。
[0064]
3.3细胞增殖实验
[0065]
(1)将1
×
103个fhc细胞种入96孔板中，注意：96孔板细胞培养板周围一圈不种细胞，在37℃、5％co2培养箱培养；
[0066]
(2)24h后换液，分别于0h、12h、24h、36h及48h后加入cck
‑
8试剂，10μl每孔，2小时后利用酶标仪检测450nm处吸光度。
[0067]
3.4 rna提取
[0068]
(1)样品准备：细胞吸除培养基，用pbs清洗1～2次，随后每孔加入1000μl trizol试剂，使用去rnase酶枪头吹匀后，移置rnase free的1.5ml离心管中，存于
‑
80℃冰箱代提取；动物组织取样完成后，加入1ml trizol和灭菌的小钢珠。置于匀浆器中，调整转速6.0，30s，使样本成为组织匀浆；
[0069]
(2)细胞/组织充分研磨后静置5min，将混合液转移至1.5ml无核酶ep管中并做好标记；
[0070]
(3)加入200μl氯仿颠倒数次混匀，室温静置5min，12000g离心15min，4℃离心；
[0071]
(4)小心地转移上层水相400μl至新的无核酶ep管中，加400μl等量异丙醇颠倒混匀，室温静置10～20min，12000g离心10min，4℃离心，弃上清；
[0072]
(5)加入1ml冰冷的depc水配置的75％乙醇，7500g离心5min，4℃离心，弃上清；
[0073]
(6)室温10min晾干，用depc或无核酶水溶解吹打混匀，rna的浓度及纯度用nanodrop
tm
2000测定。
[0074]
3.5实时荧光定量pcr(rt
‑
qpcr)
[0075]
引物设计是通过primer5(http://sourceforge.net/projects/primer5/)在线引物设计网站进行设计，然后我们利用ncbi basic local alignment search tool(blast)工具进行比对来确保产物的特异性。利用takara试剂盒逆转录为cdna，按照特定pcr反应体系和反应条件，利用sybr green法检测相应的基因表达水平，gapdh被用作内参。
[0076]
4.数据及统计学处理
[0077]
采用spss20.0统计分析软件分析，计量资料以均数
±
标准差表示，两样本均数之间的比较，经正态性检验和方差齐性分析后，选择t或t'检验，p<0.05表示差异具有统计学意义。
[0078]
5.实验结果
[0079]
5.1小分子肽干预后nec模型细胞凋亡减少、增殖恢复，降低炎症因子释放
[0080]
通过流式细胞仪检测细胞凋亡，结果发现，a肽和b肽都可不同程度降低lps诱导的细胞凋亡，而b肽(lqplmqqvpqpip)效果更为显著(如图1所示，差异有统计学意义)，几乎完全抑制了lps诱导的细胞凋亡。进一步检测两种小分子肽对细胞增殖的影响，结果显示fhc细胞的增殖能力恢复明显，且b肽的作用更为显著(如图2所示)。
[0081]
已知nec过程中炎症信号过度激活，炎症介质大量释放，我们同时检测了小分子肽对炎症水平的影响。rt
‑
qpcr结果如图3所示，可见lps刺激后，nec模型细胞中tnf
‑
α、il
‑
6的表达显著升高，而a肽和b肽都可不同程度降低tnf
‑
α、il
‑
6的mrna水平，且相较于a肽，b肽能更显著降低tnf
‑
α、il
‑
6的mrna水平(p<0.05)。上述结果表明，小分子肽能降低lps引起的炎症因子释放，提示肠上皮细胞炎症得到缓解。
[0082]
实施例2小分子肽对nec大鼠模型的作用
[0083]
1.实验动物
[0084]
从南京医科大学动物实验中心购得spf级新生sd大鼠及其母鼠，将其饲养于南京医科大学实验动物中心，饲养于12h光/暗周期，室温24℃，湿度50％的环境中。
[0085]
2.实验分组
[0086]
设置control组(con组)、nec组、nec+a肽及nec+b肽组。
[0087]
3.实验方法
[0088]
3.1 nec动物模型构建
[0089]
将出生24h内体重在6～9g的sd大鼠随机分为三组，nec组：所有新生大鼠每6～8h缺氧窒息一次(5％o2，95％n2，5min)，缺氧结束后2min内完成高渗奶(惠氏1段奶粉：雅培出生幼犬奶粉2:1，50μl/mg)灌胃，同时早晚分别于4℃恒温箱内冷刺激5min。con组：将新生sd大鼠与其母鼠同笼，为其母乳喂养。nec+小分子肽组：在nec模型基础上，在每天灌胃的高渗奶中添加不同小分子肽(a肽、b肽)。整个实验持续4天，结束前2h每组存活大鼠腹腔注射brdu(50mg/kg)。最后统一以脊椎脱臼法处死大鼠，解剖胃肠道组织，注意操作轻柔，取距回肠末端2cm的近端肠组织为样本。
[0090]
病理评分：病理评分依据是nadler等人提出的病理评分标准。0分：肠道绒毛及上
皮完整，组织结构正常；1分：轻微粘膜下或固有层肿胀分离；2分：中度粘膜下和(或)固有层分离，粘膜肌水肿；3分：重度粘膜下和(或)固有层分离，粘膜下和(或)肌层水肿局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失伴坏死。
[0091]
3.2 he染色
[0092]
(1)h&e染色：将肠道组织切片用苏木素染色5min后，蒸馏水冲洗干净；
[0093]
(2)利用1％盐酸乙醇将切片分化lmin，蒸馏水洗2min；
[0094]
(3)饱和碳酸锂浸泡返蓝lmin；
[0095]
(4)用0.5％伊红液4～7min，蒸馏水漂洗干净；
[0096]
(5)利用乙醇梯度处理(95％
→
95％
→
100％乙醇)，最后用中性树胶封片。
[0097]
4.数据及统计学处理
[0098]
采用spss20.0统计分析软件分析，计量资料以均数
±
标准差表示，两样本均数之间的比较，经正态性检验和方差齐性分析后，选择t或t'检验，p<0.05表示差异具有统计学意义。
[0099]
5.实验结果
[0100]
5.1小分子肽干预能减轻大鼠肠绒毛结构损伤、炎症细胞浸润，降低血清炎症因子水平
[0101]
通过对nec大鼠分别灌胃a肽和b肽干预疾病进程，he染色结果如图4所示，可见nec模型大鼠的肠上皮细胞明显减少，正常结构遭到破坏，但是a肽和b肽处理后，肠上皮细胞生长恢复，结构趋于完整，且炎症细胞浸润均明显减轻，病理评分结果如图5所示，也印证了染色观察的结果。
[0102]
rt
‑
qpcr结果如图6所示，可见nec模型大鼠的tnf
‑
α、il
‑
6的表达较con组显著升高，但是在a肽和b肽作用下可以显著降低nec大鼠血清中二者的mrna水平，且b肽效果更显著，表明在a肽和b肽处理下，大鼠nec症状得到改善，且b肽效果更为显著。
[0103]
上述体内实验与体外实验均证明，该小分子肽可减少肠上皮细胞凋亡并恢复增殖，还可以减轻肠绒毛结构损伤、炎症细胞浸润，降低炎症因子水平，从而可以用于治疗肠上皮细胞损伤相关疾病，例如可用于改善坏死性小肠结肠炎(nec)等。
[0104]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0105]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。