一种快速、高效制备原生柞蚕丝素蛋白粉的方法

1.本发明涉及了一种蚕丝素蛋白产品的制备方法，尤其是涉及一种快速、高效制备原生柞蚕丝素蛋白粉的方法，属于天然高分子领域。


背景技术：

2.柞蚕蚕茧主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，脱胶过程可去除丝胶蛋白而得到纤维状的柞蚕丝素纤维。柞蚕丝素是一种典型的天然蛋白质聚合物，具有优良的生物相容性、可降解性和低免疫原性。由于其一级序列的重复结构片段与蜘蛛丝牵引丝的一级序列相似，富含丙氨酸和β
‑
折叠结构，同时具有从微观到纳观的多层级结构，因此赋予了柞蚕丝纤维超强的机械强度，如高模量，拉伸强度等。与此同时，柞蚕丝素中含有较多的人体所需的必须氨基酸和高度重复的rgd(arg
‑
gly
‑
asp)三肽，而rgd三肽具有重要生理功能，能促进细胞的粘附和生长，使其在生物医药领域具有潜在的应用价值，如将柞蚕蛋白多孔支架用于细胞培养、组织修复和药物载体等。
3.目前，我国柞蚕原料茧年产8.0万吨以上，柞蚕蚕丝产量约占世界总产量的3/4，柞蚕丝蛋白资源十分丰富，而利用柞蚕茧生产柞蚕丝素粉是提高其经济效益和功能利用的有效途径。长期以来，由于受柞蚕丝素蛋白提取及加工方式的限制，柞蚕丝的主要应用方向仍集中在纺织行业，并没有发挥出柞蚕丝的最大利用价值。近年来，虽然家蚕丝素粉作为一种新的蛋白质来源，在化妆品、生物医药、食品保鲜和环保领域发挥重要作用，然而具有比家蚕丝素蛋白生物学性能更优的柞蚕丝素蛋白在生物医药领域的应用的报道却很少。究其原因，正是因为柞蚕丝纤维存在的类蜘蛛丝氨基酸片段、高β
‑
折叠结构、多层级结构使得其纤维形态不易破坏和断裂，从而对其后续的加工以及材料的再制造产生阻碍，如果简单地套用家蚕丝素蛋白粉的加工方式又难以成功。
4.截至目前制备柞蚕丝素粉的方式主要包括物理、化学、生物学方法。化学处理方法一般是将脱胶后的柞蚕纤维用酸(盐酸)、碱(氢氧化钠)、中性盐(如硫氰酸锂)等高温处理，并进行水解、透析、纯化、喷雾干燥等后处理步骤制得。该方法不仅破坏了柞蚕丝素的天然原生结构和rgd序列，使得柞蚕丝肽链变性、生物相容性降低，丧失生物功能性，且存在加工时间长、操作过程繁琐、成本高、环境污染等问题。如申请日为2013年3月20日，公开号为cn102977381a的中国专利中，公开了一种柞蚕丝素蛋白微球及其制备方法，该方法通过将柞蚕纤维溶解在liscn溶剂中，并调节溶液的ph值3～6，制备了粒径可控的柞蚕丝素蛋白微球(粉粒)。上述制备方法使用的有毒溶剂liscn残留会丧失蛋白颗粒的活性以及降低生物相容性，也给环境带来了沉重的负担。生物学处理方法主要是酶解法，酶解法通常采用活性蛋白酶将柞蚕丝素纤维酶解后进行喷雾干燥处理。但是该方法需要严格的温度和ph条件以防止酶失活，同时酶解过程中也需要借助化学药品的辅助作用，制备过程缓慢，效率和产量都很低，限制了酶解法制备柞蚕丝素粉末的进一步应用。通过物理法如高温高压法，无需采用任何化学药品，可以克服化学和生物法制备丝素粉的部分缺点。但高温高压法制备条件苛刻(约200摄氏度，1.96mpa)，对设备要求高，能耗高，还需要与其他多种物理手段(如高压
均质机)联用才能制备柞蚕丝素粉末(颗粒尺寸往往大于100微米)，且此过程中高温环境易产生碳化产物，破坏了柞蚕丝纤维的原生结构和肽链结构。
5.综上所述，由于柞蚕丝纤维具有优越的力学强度和复杂的结构组成，使得制备柞蚕丝素粉末成为研究上和产业上亟待解决的难题，至今还没有出现一种能够既保留柞蚕丝素的原生结构和功能多肽结构，又能快速、高效、无污染制备出原生柞蚕丝素粉末的方法，导致柞蚕丝素粉的产量有限，产业附加值降低。


技术实现要素：

6.为了克服现有制备柞蚕丝素粉末技术中存在的对环境不友好、制备方法繁琐、破坏蚕丝天然结构的缺陷，本发明提出了一种快速、高效制备原生柞蚕丝素粉的方法。本发明方法特殊针对柞蚕进行处理，通过特定的破碎方式获得了具有优异生物性能的原生柞蚕丝素粉，具有快速、高效、无污染等特点，并能保留柞蚕丝素蛋白的生物学功能以及纳米尺度的天然构象结构(原生结构)，克服现有加工柞蚕丝素粉方法所带来诸多问题。
7.为了实现上述目的，本发明提供的技术方案采用了如下具体步骤：
8.(1)将清洗过的柞蚕茧壳放入质量分数为0.75％的碳酸钠溶液中煮沸0.5h，将柞蚕茧壳取出再重复一次煮沸，脱去丝胶，洗净后放入烘箱中烘干，获得干燥后的柞蚕丝素纤维；
9.(2)将干燥后的柞蚕丝素纤维进行特定的破碎处理获得微米级的柞蚕丝素粉。
10.所述步骤(1)中的加工原料不仅包括柞蚕丝素纤维，还可用于柞蚕茧壳、柞蚕茧下脚料等蚕丝类型，但不限于此。
11.所述步骤(2)具体为：
12.将干燥后的柞蚕丝素纤维装入旋盖式不锈钢破碎罐，并放入一颗不锈钢旋转珠，盖紧盖子，再浸入液氮、低温冰箱或干冰中进行冷冻，将充分冷冻后的破碎罐固定在不锈钢适配器上，启动低温冷冻破碎机进行破碎，过筛后制备获得粒径为微米级的柞蚕丝素粉。
13.所述的冷冻破碎机设定频率为30
‑
60hz，时间为10
‑
120s。
14.本发明针对柞蚕丝素纤维采用破碎罐和旋转珠配合的特定破碎方式进行处理，实现了微米级的破碎，但不会产生纳米级的破坏。
15.所述步骤(2)中的冷冻温度应低于
‑
30℃，优选温度范围为
‑
80℃
‑‑
196℃。
16.所述步骤(2)中的柞蚕丝素粉经过不同目数过筛后，筛选出不同粒径、颗粒均匀的微米级柞蚕丝素粉。
17.所述步骤(3)中所得的柞蚕丝素粉含有不受破坏的rgd多肽序列。
18.本发明所得的柞蚕丝素粉含有的rgd多肽序列不受破坏，能够促进哺乳动物细胞的早期黏附和生长。
19.本发明通过将柞蚕丝素纤维进行低温冷冻，使其塑化变脆，并完全以物理机械方式直接将天然的柞蚕丝素纤维破碎成柞蚕丝素粉末。可在最短10s内将纤维状丝加工成微米级粉末，所制得柞蚕丝素粉末对哺乳动物细胞无毒副作用，且能显著促进细胞的早期粘附。
20.具体地，在高频振荡模式下，破碎罐中的不锈钢旋转珠做圆弧径向摆动，会高速冲击冷冻柞蚕纤维，产生的巨大摩擦力、低温冻结力、撞击力能快速破坏丝纤维，得到微米级
粉末。由于存在低温冷冻过程，能保护柞蚕丝素纤维在高频作用下不会被碳化，同时蛋白分子的结构完整性得到保留，从而得到的柞蚕丝素粉具有纳米原纤维形态，完整的β
‑
折叠构象和rgd多肽结构。
21.本发明操作简便、成本低廉、对环境无污染，制得的柞蚕丝素粉在组织工程、化工、生物医药、食品和环保领域等具有广泛的应用前景。
22.与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：
23.(1)本发明不需要任何其它的化学产品处理柞蚕丝素纤维，只需要简单的操作方式就可以将天然的柞蚕丝素纤维制备成柞蚕丝素粉末。
24.(2)本发明在低温条件下加工，可以有效预防柞蚕丝素蛋白分子因压力和受热而降解，更加完整的保留了柞蚕丝素在纳米尺度的结构。
25.(3)与现有的柞蚕丝素粉末制备技术相比，本发明生物安全性高，操作简单方便，高效，对环境无污染。
26.(4)本发明制备的粉末保留了丝素的天然结构、良好的生物相容性，在食品、化工、医药、生物材料等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
27.图1为实施例1中得到的柞蚕丝素粉末实物图。
28.图2为实施例1中得到的柞蚕丝素粉末扫描电镜图。
29.图3为实施例2中得到的柞蚕丝素粉末扫描电镜图。
30.图4为实施例2中成纤维细胞在柞蚕丝素粉/丝素膜上的细胞粘附图。
31.图5为实施例2中成纤维细胞在柞蚕丝素粉/丝素膜上的细胞粘附数量图。
32.图6为实施例4中得到的家蚕丝粉末实物图。
33.图7为实施例4中得到的家蚕丝粉末扫描电镜图。
具体实施方式
34.下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
35.本发明的实施例如下：
36.实施例1
37.本实施例中一种快速、高效制备原生柞蚕丝素粉的方法依次包括如下步骤：
38.(1)将清洗过的柞蚕茧壳放入0.75％碳酸钠溶液中煮沸0.5h，重复一次该步骤，脱去丝胶，洗净，放置50℃烘箱烘干备用。
39.(2)取步骤(1)中脱胶后的柞蚕丝纤维1.0g放入破碎罐，并放入1粒不锈钢旋转珠，盖紧盖子。将装好样品的破碎罐浸入液氮中预冷2分钟，取出后快速固定在破碎仪的不锈钢适配器上。频率设定为30hz，时间设定为30s，即可制备柞蚕丝素粉末。
40.(3)将步骤(2)得到的柞蚕丝素粉末移入100目标准筛内，经过过筛分离后即可制备得到粒径为50
‑
100微米的柞蚕丝素粉末(如图1和图2所示)。
41.实施例2
42.(1)将清洗过的柞蚕茧壳放入0.75％碳酸钠溶液中煮沸0.5h，重复一次该步骤，脱
去丝胶，洗净，放置50℃烘箱烘干备用。
43.(2)取步骤(1)中脱胶后的柞蚕丝纤维0.2g放入破碎罐，并放入1粒不锈钢旋转珠，盖紧盖子。
44.将装好样品的破碎罐浸入液氮中预冷10分钟，取出后快速固定在破碎仪的不锈钢适配器上。频率设定为60hz，时间设定为60s，即可制备柞蚕丝素粉末(如图3所示)。
45.(3)将步骤(2)得到的柞蚕丝素粉末移入100目标准筛内，经过过筛分离后即可制备得到粒径为20
‑
50微米的柞蚕丝素粉末。
46.(4)取步骤(3)中的柞蚕丝素粉末，按柞蚕丝素粉末与浓度为5％的丝素蛋白溶质量比为1∶99以及5∶95将柞蚕丝素粉末充分分散于丝素蛋白溶液中，常温下自然晾干24小时，得到柞蚕丝素粉末与丝素溶液共混膜。
47.(5)将步骤(4)中的共混膜接种l929成纤维细胞，在培养箱中培养三小时，观察细胞在不同共混膜上的早期粘附情况。细胞在纯丝素膜(sf)上的粘附数量较低；当共混膜中的柞蚕丝素粉末占比为1wt％时(sft1)，粘附数量高于纯丝素膜；当共混膜中的柞蚕丝素粉末占比为5wt％(sft5)时，细胞粘附数量显著性高于sft1膜(如图4和图5所示，图4中箭头所指为细胞)。可见，本发明制备的柞蚕丝素粉末能有效促进细胞在材料表面的早期粘附。
48.从有效促进细胞粘附能够反映出，本发明的产物能够有效预防柞蚕丝素蛋白分子因压力和受热而降解，完整地保留了柞蚕丝素在纳米尺度的蛋白结构和分子结构。
49.实施例3
50.(1)称取剪碎的柞蚕茧壳0.5g放入破碎罐，并放入不锈钢旋转珠，盖紧盖子。
51.(2)将步骤(1)装好样品的破碎罐浸入
‑
80度冰箱中预冷30分钟，取出后快速固定在破碎仪的不锈钢适配器上。频率设定为60hz，时间设定为60s，即可制备柞蚕茧粉末。
52.(3)将步骤(2)得到的柞蚕粉末移入100目标准筛内，经过过筛分离即可制备得到粒径为20
‑
100微米左右的柞蚕茧粉末。
53.实施例4
54.(1)称取家蚕丝纤维1.0g装入破碎罐，并放入1不锈钢旋转珠，盖紧盖子。
55.(2)将装好样品的破碎罐浸入干冰中预冷1小时，取出后快速固定在破碎仪的不锈钢适配器上。频率设定为30hz，时间设定为120s，即可制备蚕丝粉末。
56.(3)将步骤(2)得到的蚕丝粉末移入100目标准筛内，经过过筛分离后即可制备得到粒径为100微米左右的家蚕丝粉末(如图6和图7所示)。