一种富集扩培互养型乙酸氧化细菌的方法

1.本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种快速富集扩培互养型乙酸氧化细菌的方法。


背景技术：

2.厌氧消化作为高效的生物处理技术之一，已经在易降解生物质废物(如餐厨余垃圾、城市污泥、畜禽粪便、高浓度有机废水等)资源化方面得到了较为广泛的应用。但在运行过程中为了提高容积产气率，降低单位生产成本，厌氧消化工程多在高负荷条件下运行；而高负荷厌氧消化系统容易产生氨抑制、挥发性脂肪酸抑制以及氨和挥发性脂肪酸的双重抑制，导致厌氧发酵系统失稳、甚至崩溃。
3.针对上述高负荷厌氧消化过程中产生的高氨氮和高挥发性脂肪酸产生的抑制问题，国内外研究人员发展了一系列方法来解除厌氧消化反应器中的抑制问题。例如，设计新式反应器(cn201644487u、cn202089962u和cn201644487u)、添加碳材料(cn109182390a、cn109554402a、cn107475304a和cn112744991a)、采用复合纳米纤维膜吸附和离子交换树脂装置去除氨氮(cn112342694a、cn102992478b)等。但是这些设计的新式厌氧消化反应器并不适用于已产生抑制的厌氧消化反应器。投加的碳材料在厌氧消化过程中会流失，需要不断补充碳材料来弥补流失的碳材料，同时碳材料浸出物对厌氧消化过程中的微生物具有潜在的毒害作用。而采用复合纳米纤维膜吸附和离子交换树脂装置会产生废液，需要对产生的废液进行处理，增加了处理成本。而且若发酵系统在高氨氮和高挥发性脂肪酸双重抑制的时候，上述技术并不能起到有效的缓解作用，只能减少或停止进料、大比例回流沼渣或者外源接种物、甚至完全清空反应器，无法保证正常的废物处理能力，并且造成很大的经济损失。因此，有必要开发一种能够快速有效恢复失稳厌氧消化系统的恢复剂。
4.互养型乙酸氧化菌(saob)能够在高氨氮和高挥发性脂肪酸的环境中生存，并且与h2利用型产甲烷菌形成高氨氮和高挥发性脂肪酸抑制状态下的主要产甲烷途径。进行互养型乙酸氧化菌的快速富集及扩培有望缓解厌氧消化系统中产生的高氨氮和高挥发性脂肪酸的抑制问题。但是，目前有关互养型乙酸氧化菌的科学认识还非常少，能分离培养鉴定出的互养型乙酸氧化菌仅二十余种，且因为是绝对厌氧菌，其生长极其缓慢，如何快速富集和扩培是工程化应用面临的严峻挑战。由于厌氧消化系统中的菌群温度敏感性存在差异，因此可望通过控制温度和发酵时间进行saob的定向富集培养，而目前该方面研究尚未见报道。而且，当厌氧消化系统出现氨、酸等抑制失稳问题时，操作人员常规操作是绝对维持温度不变，以避免温度波动可能导致的干扰；对于高温厌氧消化系统(50
‑
55℃)出现失稳问题时，或者绝对维持温度不变，或者降温为中温厌氧消化，以缓解游离氨的抑制，但是，现有技术存在不稳定、成本高及产生环境污染等问题。因此，基于本技术的原理与技术水平方面的优势，有望在解除发酵系统的抑制的稳定性与运行成本方面获得市场认可。


技术实现要素：

5.为了克服现有研究解除厌氧反应系统中抑制技术的缺点和不足，本发明提供一种以易降解生物质废物、高浓度废水为原料，通过控制厌氧消化过程中的温度和发酵时间快速富集扩培互养型乙酸氧化菌的方法，为解除厌氧消化系统的抑制失稳问题提供新思路。即通过提高消化温度来实现快速富集扩培能高效降解有机酸并耐受高浓度氨氮的互养型乙酸氧化菌，从而实现失稳厌氧消化系统的恢复，以及高负荷厌氧消化体系的快速启动。
6.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
7.一种富集扩培互养型乙酸氧化细菌的方法，其包括：
8.将易降解生物质废物与接种物混合后得到发酵液，然后将发酵液置于消毒的厌氧微生物扩培反应器中，通过控制发酵温度和发酵时间进行厌氧消化反应；
9.厌氧消化反应中有效积温由下式计算得到：
10.t＝∑(t
i
‑
t0)
×
δt
11.其中，t：反应积温，单位(℃.d)；
12.t
i
：为某一恒定温度；
13.t0：为消化反应系统中微生物的开始繁殖温度；
14.δt：为恒定温度持续的天数；
15.53℃≤t
i
≤67℃，20℃≤t0≤25℃，17d≤δt≤41d。
16.作为本发明优选地，易降解生物质废物与接种物基于vs的比例为1∶1
‑
1∶5。
17.作为本发明优选地，易降解生物质废物选自餐厨余垃圾、城市污泥和畜禽粪便中的一种以上。
18.作为本发明优选地，接种物选自厌氧消化厂的污泥或沼渣。
19.作为本发明优选地，发酵液的含固率为5
‑
10wt％。
20.作为本发明优选地，厌氧消化反应在55
±
2℃下反应41天，有效积温为1148℃
·
d＜t＜1312℃
·
d时，互养型乙酸氧化菌的丰度达到68％。
21.作为本发明优选地，厌氧消化反应在59
±
2℃下反应41天，有效积温为1312℃
·
d＜t＜1476℃
·
d时，互养型乙酸氧化菌的丰度达到74％。
22.作为本发明优选地，厌氧消化反应在62
±
2℃下反应41天，有效积温为1476℃
·
d＜t＜1599℃
·
d时，互养型乙酸氧化菌的丰度达到87％。
23.作为本发明优选地，厌氧消化反应在65
±
2℃下反应41天，有效积温为1599℃
·
d＜t＜1722℃
·
d时，互养型乙酸氧化菌的丰度达到80％。
24.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
25.第一、本发明针对高氨氮高挥发性脂肪酸抑制的厌氧发酵系统，提供解除方法，无需大比例回流接种物或完全清空反应器，可以使失稳的发酵系统恢复稳定运行状态。具体为将厌氧环境中的混合微生物菌群定向塑造为以互养型乙酸氧化菌为主导菌的体系。即通过精调控制厌氧消化系统的发酵温度，刺激提高互养型乙酸氧化菌的竞争优势，进而实现互养型乙酸氧化菌的快速定向富集及扩培，无需外源添加剂、节省成本、作用效果明显，且调控方便简易，容易实现自动化，发酵条件易于控制、无二次污染。
26.第二、本发明可以通过温度和反应时间控制实现互养型乙酸氧化菌的富集及扩培；在41天内，互养型乙酸氧化菌的丰度即可达到68％以上，富集速率高，累积的有机酸显
著快速降解。
附图说明
27.图1为本发明的易降解生物质废物在不同反应温度下的互养型乙酸氧化菌的丰度图。
具体实施方式
28.本发明提供了一种富集扩培互养型乙酸氧化细菌的方法。
29.本发明的富集扩培互养型乙酸氧化细菌的方法包括：
30.将易降解生物质废物与接种物混合后得到发酵液(含固率为5
‑
10wt％)，然后将发酵液置于备用的厌氧微生物扩培反应器中，通过控制发酵温度和发酵时间进行厌氧消化反应。
31.发酵温度及发酵时间的控制取决于累计的有效积温，由下式计算得到：
32.t＝∑(t
i
‑
t0)
×
δt
33.其中，t：反应积温，单位(℃
·
d)；
34.t
i
：为某一恒定温度；
35.t0：为消化反应系统中微生物的开始繁殖温度；
36.δt：为恒定温度持续的天数；
37.53℃≤t
i
≤67℃，20℃≤t0≤25℃，17d≤δt≤41d。
38.其中，易降解生物质废物与接种物基于vs的比例可以为1∶1
‑
1∶5，优选为1∶2
‑
1∶5。
39.易降解生物质废物为进行预处理之后形成的较为均一物料，即选自餐厨余垃圾、城市污泥和畜禽粪便中的一种以上。
40.接种物选自厌氧消化厂的污泥或沼渣。
41.备用的厌氧微生物扩培反应器要经过清洗消毒，包括首先向扩培反应器中注满净水，并进行搅拌，然后将扩培反应器中的水加热至110℃，保持10
‑
20min，放掉净水，将扩培反应器备用。
42.互养型乙酸氧化菌的丰度取决于最低特定反应温度(53℃以上)和特定温度下的反应时间(41天)，则最低有效积温在1148℃
·
d以上。
43.如图1所示，厌氧消化反应在55
±
2℃下反应41天，有效积温为1148℃
·
d<t<1312℃
·
d时，互养型乙酸氧化菌的丰度达到68％。
44.厌氧消化反应在59
±
2℃下反应41天，有效积温为1312℃
·
d<t<1476℃
·
d，互养型乙酸氧化菌的丰度达到74％。
45.厌氧消化反应在62
±
2℃下反应41天，有效积温为1476℃
·
d<t<1599℃
·
d时，互养型乙酸氧化菌的丰度达到87％。
46.厌氧消化反应在65
±
2℃下反应41天，有效积温为1599℃
·
d<t<1722℃
·
d时，互养型乙酸氧化菌的丰度达到80％。
47.本发明的互养型乙酸氧化菌在厌氧消化反应中的机理：
48.本发明以易降解生物质废物、高浓度有机废水为原料，采用特定温度在厌氧消化系统中定向塑造微生物的种类，刺激提高互养型乙酸氧化菌的竞争优势。互养型乙酸氧化
菌能够在高氨氮和高脂肪酸抑制的厌氧消化系统中与h2利用型产甲烷菌形成主要的产甲烷途径，从而达到解除易降解生物质废物厌氧消化系统中高氨氮和高挥发性脂肪酸引起的抑制失稳问题，该方法能够实现快速消耗过量的挥发性脂肪酸、缩短甲烷化迟滞期，最终恢复反应器的正常运行能力，维持系统的稳定运行，因此，风险可控。
49.以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
50.实施例1：
51.本实施例的富集扩培互养型乙酸氧化细菌的方法包括：
52.将易降解生物质废物破碎处理后，装入专用厌氧微生物扩培反应器中，加入基于vs的比例为1:3的接种物，含固率调至5wt％，混合后调节ph为7.0，然后进行密封，使用高纯n2(>99.99％)置换扩培反应器中的气体，保持厌氧环境。将扩培反应器的运行温度设置恒温为55℃，反应时间41天，有效积温达到1230℃
·
d，互养型氧化乙酸菌的丰度达到68％。微生物丰度的测定方法为采集液体样品，先以15200rpm离心10min，去除上清液之后，得到固体样品，然后使用powersoil dna分离试剂盒(mobio laboratories inc.,ca)提取样本dna。使用miseq平台(pe300)进行测序。利用引物515f(5
‑
gtgccagcmgccgcggtaa，seq id no.1)和806r(5
‑
ggactacvsgggtatctaat，seq id no.2)扩增16s rrna基因v4区，获得细菌组成。
53.实施例2：
54.易降解生物质废物破碎预处理过程、扩培反应器中的物料及菌剂接种流程、样品的预处理及微生物测序方法与实施例1相同。控制反应温度为59℃水浴锅中，反应时间41天，有效积温达到1394℃
·
d，互养型氧化乙酸菌的丰度达到74％。
55.实施例3：
56.易降解生物质废物破碎预处理过程、扩培反应器中的物料及菌剂接种流程、样品的预处理及微生物测序方法与实施例1相同。控制反应温度为62℃水浴锅中，反应时间41天，有效积温达到1517℃
·
d，互养型氧化乙酸菌的丰度达到87％。
57.实施例4：
58.易降解生物质废物破碎预处理过程、扩培反应器中的物料及菌剂接种流程、样品的预处理及微生物测序方法与实施例1相同。控制反应温度为65℃水浴锅中，反应时间41天，有效积温达到1640℃
·
d，互养型氧化乙酸菌的丰度达到80％。
59.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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