一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的鱼源胶原蛋白水解物的制备与应用。


背景技术：

2.近年来,胃病发病率逐年升高，而许多胃病都与胃黏膜损伤有关。大量或长期酗酒是引起胃肠道疾病的主要原因之一。近年来， 随着人们的生活质量与水平逐渐提高，人们的生活习惯与饮食结构发生了很大的变化。我国胃溃疡的发病率呈逐年上升的趋势，如何有效控制及治疗胃溃疡是一个比较热门的课题。
3.中国专利申请cn202010056918公开了一种用于修复受损胃黏膜的海参肽及其制备方法，将新鲜海参预处理后粉碎制得料液，在蒸煮罐内加热维持料液的温度在38～39℃；将料液从蒸煮罐泵入自溶反应器，反应后返回蒸煮罐；重复该步骤进行循环自溶反应，当料液滴速达到设定值终止反应；收集料液，经过初虑、灭酶、脱色、膜过滤，得到相对分子量为5500-6500da的滤液，该制备方法得到的海参肽有别于采用酶水解方法制得的海参肽，是通过东海海参自溶液制得的，并且具有高效、快速修复动物受损胃黏膜的功能。
4.中国专利申请cn202110304423公开了一种具有抗胃肠溃疡功效的鱼肽蛋白粉组合物及其制备方法，以重量份计，包括下述原料制备而成：水解蛋白粉80～100份、马兰6～12份、芦丁6～12份、桔梗6～12份、羧甲基纤维素0.5～2.5份、醋酸酯淀粉0.5～2.5份、花椒1～3份和益生菌1～3份。该组合物营养丰富，具有预防及治疗猪胃肠溃疡的功效，并且该组合物还具有增强肠道免疫力，提高新陈代谢的能力，达到抗病促进生长的目的。
5.中国专利申请cn202010222340公开了一种具有解酒作用的组合物，该组合物包括胶原蛋白及其部分水解产物，为以鱼、牛、猪为原料，通过提取、浓缩、部分水解制得胶原蛋白或其变性胶原蛋白以及它们的混合物及其部分水解产物。该活性成分对各种因素诱发的胃溃疡、十二指肠溃疡具有极显著的预防和治疗效果。
6.金枪鱼是一种应用较为广泛的商业鱼类产品。加工金枪鱼产品会产生大量的副产品，如骨骼、内脏和皮肤。众所周知，这些副产品中含有大量的蛋白质。另一方面，商业上可用的蛋白质类产品大多来自猪和牛。然而，考虑到宗教和饮食习惯等问题，鱼源胶原蛋白水解物便成为了一个很好的选择。已有研究表明，鱼源胶原蛋白水解物具有多种生物活性，比如抗氧化活性以及抗炎活性。因此鱼源胶原蛋白水解物有可能成为治疗酒精引起的胃溃疡等疾病的食品和药物的潜在来源。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的鱼源胶原蛋白水解物及其应用。该鱼源胶原蛋白水解物具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的功能，并且无细胞毒性，具有补充人体必须氨基酸
的能力及营养功能，可用其制备出的相关食品、保健品或药物用于治疗由于酒精引起的胃溃疡有关的疾病。
8.为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案：一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的鱼源胶原蛋白水解物，所述鱼源胶原蛋白水解物是从金枪鱼源原料中提取。
9.本发明还保护所述的的鱼源胶原蛋白水解物的制备方法，通过对蛋白质破坏较小的水热法结合定向蛋白酶酶切技术提取。
10.作为优选技术方案，所述的制备方法具体步骤如下：（1）前处理：称取新鲜的金枪鱼源原料，切碎成均匀块状后脱脂；（2）匀浆：于室温下，前处理后原料加入去离子水进行充分匀浆，制得匀浆液，其中前处理后原料与去离子水的质量比为1:3-1:5；（3）酶解：调节匀浆液ph值至9，加入添加量1-3%（w/w）的碱性蛋白酶，在温度60-70℃酶解3-5小时；（4）离心分离：将步骤（5）酶解结束后的酶解液高温煮沸30-60min进行灭酶与杀菌，之后于8000-12000rpm的条件下离心15-20min，微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液；（5）透析：将微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液放入透析袋中进行透析2-3天；（6）干燥：对透析后的鱼源胶原蛋白水解物溶液进行冷冻干燥，制得鱼源胶原蛋白水解物。
11.本发明还保护所述的的鱼源胶原蛋白水解物在制备用于预防和治疗由于酒精引起的胃溃疡有关的疾病的产品中的应用。
12.作为优选技术方案，所述的产品包括食品、保健品和药物。
13.与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明所述的鱼源胶原蛋白水解物是从金枪鱼中天然提取，具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的功能，无细胞毒性，并且具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能，用其制备出的相关食品、保健品或药物用于预防和治疗由于酒精引起的胃溃疡的食品或药物具有潜在的应用价值以及广阔的应用前景。
具体实施方式
14.下面结合实施例用于说明本发明作进一步详细的描述，但不用来限制本发明的范围。
15.如无特殊说明，本发明所制备的蛋白水解物处理细胞24小时后，采用cck-8法检测细胞生长情况。细胞培养完成后，吸出孔中液体。每孔加入100μl含有10% cck-8的dmem培养基，在37℃下孵育1-4h。使用酶标仪测定孔在450nm处的吸光度值。细胞存活率（%）=加药孔od值/对照孔od值
×
100%。实验重复3次。
16.实施例1一种鱼源胶原蛋白水解物，其选用金枪鱼源原料，通过定向蛋白酶酶切技术提取，具有修复由乙醇造成的人胃黏膜细胞损伤的功效，其制备方法具体步骤如下：（1）前处理：称取新鲜的金枪鱼源原料，切碎成均匀块状后脱脂；（2）匀浆：于室温下，前处理后原料的按液料质量比为1：3（kg/kg）加入质量去离子
水后进行充分匀浆，制得匀浆液；（3）酶解：调节匀浆液ph值至9，加入添加量1%（w/w）碱性蛋白酶，温度60℃酶解3-5小时；（4）离心分离：将步骤（5）酶解结束后的酶解液高温煮沸30min进行灭酶与杀菌，之后于10000rpm的条件下离心15min，微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液；（5）透析：将微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液放入透析袋中进行透析2-3天；（6）干燥：对透析后的鱼源胶原蛋白水解物溶液进行冷冻干燥，制得鱼源胶原蛋白水解物。
17.实施例2本发明鱼源胶原蛋白水解物对修复乙醇造成的人胃黏膜细胞（ges-1细胞）损伤的影响1、建立酒精损伤ges-1细胞模型将ges-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100 μl，含6
×
104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用dmem完全培养液稀释无水乙醇，然后将稀释的无水乙醇加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100 μl细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100 μl，乙醇终浓度分别为1%, 2%，3%，4%。5%，6%，7%，8%和9%（v/v）。加入不同浓度乙醇后，细胞继续培养24小时。培养完成后，吸出孔中液体。每孔加入100 μl含有10%cck-8的dmem培养基，在37℃下孵育2-4h。使用酶标仪测定孔在450nm处的吸光度值。
18.细胞存活率（%）=加药孔od值/对照孔od值
×
100%。实验重复3次。
19.不同浓度乙醇损伤人胃黏膜细胞（ges-1细胞）24小时后,采用cck-8法检测细胞生长情况。以未加药的对照组细胞数为100，对各组数据作统计学分析。不用浓度的乙醇作用于人胃黏膜细胞（ges-1细胞）后，细胞活性均降低；且呈现剂量梯度依赖性，降低速率增大。当乙醇浓度为3.87% 时，细胞活性抑制率达50%。因此，建立乙醇损伤人胃黏膜细胞（ges-1细胞）模型的条件为3.87%乙醇作用ges-1细胞24小时。
20.2、修复由酒精引起的人胃黏膜细胞（ges-1细胞）损伤将ges-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100 μl，含6
×
104个细胞，使细胞贴壁。孵育培养24h后，加入100 μl浓度为3.87%乙醇，对照孔只加100 μl dmem完全培养液。乙醇损伤ges-1细胞24小时后，用dmem完全培养液稀释鱼源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100 μl细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100 μl，鱼源胶原蛋白水解物药物终浓度分别为100 μg/ml，200 μg/ml，400 μg/ml，600 μg/ml，800 μg/ml和1000 μg/ml。
21.鱼源胶原蛋白水解物处理由乙醇引起的人胃黏膜细胞（ges-1）损伤24小时后，采用cck-8法检测细胞生长情况。以未加药的对照组细胞数为100，对各组数据作统计学分析。鱼源胶原蛋白水解物对乙醇损伤的人胃黏膜细胞（ges-1）具有明显修复作用。活细胞数目随鱼源胶原蛋白水解物的增大而增加。与不加药的对照组相比，鱼源胶原蛋白水解物能明显修复乙醇对人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的损伤。随着鱼源胶原蛋白水解物浓度的增加，细胞存活率逐渐增大。
22.实施例3本发明鱼源胶原蛋白水解物对人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的细胞活力影响
将ges-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100μl，含6
×
104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用dmem完全培养液稀释鱼源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100μl细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100μl，鱼源胶原蛋白水解物药物终浓度分别为200μg/ml，400μg/ml，600μg/ml，800μg/ml和1000μg/ml。
23.鱼源胶原蛋白水解物药物处理人胃黏膜细胞（ges-1细胞）24小时后，采用cck-8法检测细胞生长情况。以未加药的对照组细胞数为100，对各组数据作统计学分析。鱼源胶原蛋白水解物对人胃黏膜细胞（ges-1细胞）生长的无细胞毒性。活细胞数目随鱼源胶原蛋白水解物的增大而增加。此结果说明本发明鱼源胶原蛋白水解物对人胃黏膜细胞（ges-1细胞）生长的无细胞毒性。
24.对比例1胰蛋白酶酶解制得的鱼源胶原蛋白水解物对修复乙醇造成的人胃黏膜细胞（ges-1细胞）损伤的影响。
25.将实施例1中碱性蛋白酶换为胰蛋白酶，采用与实例1中相同的酶解条件制得鱼源蛋白水解物。
26.将ges-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100μl，含6
×
104个细胞，使细胞贴壁。孵育培养24h后，加入100μl浓度为3.87%乙醇，对照孔只加100μldmem完全培养液。乙醇损伤ges-1细胞24小时后，用dmem完全培养液稀释鱼源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100μl细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100μl，胰蛋白酶酶解制得的鱼源胶原蛋白水解物药物终浓度分别为100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,600μg/ml,800μg/ml和1000μg/ml。加药后，细胞继续培养24小时。
27.对比例2碱性蛋白酶酶解制得的鸡源胶原蛋白水解物对修复乙醇造成的人胃黏膜细胞（ges-1细胞）损伤的影响。
28.采用与实例1中相同的酶解条件制得鸡源胶原蛋白水解物。
29.将ges-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100μl，含6
×
104个细胞，使细胞贴壁。孵育培养24h后，加入100μl浓度为3.87%乙醇，对照孔只加100μldmem完全培养液。乙醇损伤ges-1细胞24小时后，用dmem完全培养液稀释鸡源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100μl细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100μl，碱性蛋白酶酶解制得的鸡源胶原蛋白水解物终浓度分别为100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,600μg/ml,800μg/ml和1000μg/ml。加药后，细胞继续培养24小时。
30.表1实施例与对比例对ges-1细胞的细胞存活率比较（鱼源胶原蛋白水解物浓度1000μg/ml）
对鱼源胶原蛋白水解物影响人胃黏膜细胞ges-1细胞增殖的数据进行分析，实验数据表1明，在浓度为3.87%乙醇损伤50%ges-1细胞的细胞数目的基础上，鱼源胶原蛋白水解物能对乙醇损伤的ges-1细胞具有明显修复作用。而用胰蛋白酶处理鱼源胶原蛋白得到的鱼源胶原蛋白水解物以及碱性蛋白酶酶解制得的鸡源胶原蛋白水解物对乙醇损伤的人胃黏膜细胞（ges-1细胞）的修复效果均不如本发明鱼源胶原蛋白水解物。
31.以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。