一种菌剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.餐厨垃圾产生量大，含水率高，有机质含量，高油、高盐，同时又易腐败变质。好氧发酵是餐厨垃圾处理的重要手段之一。目前餐厨垃圾好氧发酵工艺分为两种，一种是好氧堆肥，发酵周期长，需要45
‑
60天，另一种是餐厨垃圾处理机发酵。
3.目前市面上机器设备以12
‑
48h高温加热干燥方式为主，主要存在如下问题:1)采取短时高温加热干燥，有机酸、磷酸盐积累导致产品电导率ec高；2)高温加热烘干，设备运行能耗极高，吨垃圾处理比能耗普遍大于150kkw
·
h
·
d
‑1。餐厨垃圾通过机械脱水后，含水率还高达70％，由于其有机质易于生物降解而导致很容易腐败变质，如何有效地进行脱水是亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种菌剂，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
5.为解决上述技术问题所采用的技术方案:
6.本发明的第一方面提供一种菌剂，所述菌剂包括海内氏芽孢杆菌和载体，所述海内氏芽孢杆菌的保藏编号为gdmcc61610，所述载体包括木屑和餐厨垃圾。
7.本发明所述海内氏芽孢杆菌(bacillus haynesii)，于2021年4月23日保存于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼，广东省科学院微生物研究所，邮编510075)，保藏编号为gdmcc61610。
8.参照图1，本发明提供的海内氏芽孢杆菌菌株为g
+
、好氧，菌体呈长杆状；参照图2，在pca培养基上，菌落呈白色、不透明、不规则圆状，生长迅速，50℃培养24小时后菌落直径为2
‑
3mm；参照图3，图3为不同温度下的od
600
值，可以看出该菌在50
‑
70℃生长活跃，最适生长温度为55
‑
65℃。
9.优选地，所述海内氏芽孢杆菌的16s rrna序列如seq id no:1所示，所述海内氏芽孢杆菌能耐受50
‑
70℃的高温。
10.利用引物为(27f):5
′‑
aga gtt tga tcc ctc ag
‑3′
和(1492r)5
′‑
gtt tac ctt gtt acg act t
‑3′
经pcr扩增该菌株16s rrna基因，测序结果见seq id no:1所示，将获得的基因序列提交到ncbi genbank采用blast程序进行序列分析，结果显示，海内氏芽孢杆菌菌株的基因序列与bacillus haynesii(海内氏芽孢杆菌)的相似度最高，确定该菌株为bacillus haynesii。
11.seq id no:1
12.16s ribosomal rna，partial sequence(1384bp)
13.atttgtcacttcggcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggt
gtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttagcctcgcggcttcgctgccctttgttctgcccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgtttgctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttagtaccgtcaag
14.优选地，所述海内氏芽孢杆菌的活菌数为108‑
109cfu/g。
15.本发明的第二方面提供所述菌剂的制备方法，包括以下步骤:
16.1)将所述海内氏芽孢杆菌的纯菌种接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，在45
‑
65℃下培养至长满整个斜面培养基，取活化的菌种置于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，在温度50
‑
65℃，转速120
‑
200rpm的摇床上振荡培养1
‑
2天，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按1
‑
10％的比例接种到发酵罐中的培养料中进行发酵生产，发酵罐的基本工作参数设置为:温度为50
‑
65℃，ph为6.6
‑
7.2，通气量为0.3
‑
0.6v/v
·
min，罐压:0.04
‑
0.06mpa，搅拌转速100
‑
400转/分钟，发酵24h后，取发酵液检测，当od
600
≥1.5，终止发酵，得到发酵液；
17.2)将所述发酵液以约6000r/min离心10
‑
30min，取沉淀物用无菌水稀释得到活菌浓度≥109cfu/ml的菌液；
18.3)将所述菌液与载体按照质量比为0.1
‑
10:100，搅拌混合均匀，放置于发酵箱中，室温(约25℃)条件下，进行固体发酵，培养时间48
‑
72h，检测有效活菌数≥108cfu/g，停止发酵，得到所述菌剂，菌剂含水率在10％左右。
19.优选地，餐厨垃圾为食堂剩下的饭菜，沥去汤汁，并去除塑料或骨头等大块、坚硬的部分。将木屑、餐厨垃圾按照质量比例100:(20
‑
30)混合，使混合后物料的含水率为50％
‑
60％，得到固体发酵培养基的载体。
20.本发明的第三方面提供所述菌剂在餐厨垃圾生物干化中的应用。
21.本发明的第四方面提供一种餐厨垃圾生物干化的方法，包括以下步骤:将所述菌剂与餐厨垃圾混合后进行好氧发酵。具体地，将待处理的餐厨垃圾加入到餐厨垃圾发酵箱中，与所述菌剂混合，搅拌均匀，再加入水分调节剂(可选用农业秸秆、木屑、谷壳、花生壳等)保持物料的含水率为45
‑
65％，菌剂占物料总重的3
‑
6％，保持氧气含量约为8％，约2天翻堆1次，室温(约25℃)条件下，发酵时间为6
‑
8d，当物料升温至50℃后，使物料保持50℃的时间≥5d，当物料的含水率降至35％以下，终止发酵。
22.相对于现有技术，本发明的有益效果如下:
23.本发明菌剂中的海内氏芽孢杆菌具有耐高温能力，可在高温(50
‑
70℃)条件下正常生长，热稳定性好，代谢活性不受高温发酵温度的抑制，适应性强；本发明菌剂用于处理
餐厨垃圾，能对餐厨垃圾进行快速干化，发酵6
‑
8d后，可使餐厨垃圾的水分质量减重率高达70
‑
80％。
附图说明
24.图1是本发明海内氏芽孢杆菌的显微镜图；
25.图2是本发明海内氏芽孢杆菌在pca培养基上50℃培养的菌落图；
26.图3是本发明海内氏芽孢杆菌在不同温度下的od
600
值的变化曲线图；
27.图4是实施例5生物干化过程的温度变化曲线图；
28.图5是实施例5生物干化过程的含水率变化曲线图；
29.图6是实施例6生物干化过程的温度变化曲线图；
30.图7是实施例6生物干化过程的含水率变化曲线图；
31.图8是实施例7生物干化过程的温度变化曲线图；
32.图9是实施例7生物干化过程的含水率变化曲线图；
33.图10是实施例8生物干化过程的温度变化曲线图；
34.图11是实施例8生物干化过程的含水率变化曲线图；
35.图12是实施例9生物干化过程的温度变化曲线图；
36.图13是实施例9生物干化过程的含水率变化曲线图。
具体实施方式
37.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
38.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
39.以下是本发明的实施例所用到的培养基配方：
40.牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基:牛肉膏1.5
‑
2.5g/l，蛋白胨1.5
‑
2.5g/l，葡萄糖1.5
‑
2.5g/l，ph7.2
‑
7.4(用固态naoh调节)，琼脂15
‑
20g/l。
41.牛肉膏蛋白胨液态培养基:牛肉膏1.5
‑
2.5g/l，蛋白胨1.5
‑
2.5g/l，葡萄糖1.5
‑
2.5g/l，ph7.2
‑
7.4(用固态naoh调节)。
42.实施例1：菌株的分离与鉴定
43.取约1克餐厨垃圾高温段的堆肥样品置于装有多颗小玻璃珠的250ml三角瓶中，其内置有100ml无菌水。55℃恒温摇床震荡1h后静置30min。在无菌条件下取上清液1ml，接至装有100ml已灭菌的富集培养基中(胰蛋白胨0.5％、酵母膏粉0.25％、葡萄糖0.1％)，50℃震荡培养24h，转速120r/min。取培养24h的菌悬液1ml加入到装有9ml无菌水的试管中，以梯度稀释法配置10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7的稀释度。每个稀释度分别取0.1ml涂布在淀粉选择培养基平板上(可溶性淀粉0.2％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％)，50℃培养24h。在菌落分散性较好的平板上选择有水解圈的菌落，测量菌落直径及透明圈直径，计算透明圈与菌落直径比值作为初筛指标，挑取具有最大比值的单菌落进行纯化。挑取纯化后的菌种，接种在淀粉选择培养基(可溶性淀粉0.2％、牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％)分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃恒温水浴摇床摇瓶培养24h，筛选出
能在最高温度下生长的菌种。
44.以本发明分离的上述菌株dna为模板，pcr扩增其16s rrna基因序列，引物为(27f):5
′‑
aga gtt tga tcc ctc ag
‑3′
和(1492r)5
′‑
gtt tac ctt gtt acg act t
‑3′
。pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见seq id no:1所示。获得的16s rrna基因序列通过eztaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net)进行对比，与菌株bacillus haynesii的相似度最高，同源性为99.86％。seq id no:1为基于菌株的16s rrna基因序列，利用mega软件构建系统发育树(最大似然法)，说明其系统进化关系与海内氏芽孢杆菌(bacillus haynesii)最近。
45.实施例2
46.一种菌剂，包括海内氏芽孢杆菌和载体，海内氏芽孢杆菌的保藏编号为gdmcc61610，载体包括木屑和餐厨垃圾。
47.所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
48.1)将海内氏芽孢杆菌的纯菌种接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，在55℃下培养至长满整个斜面培养基，取活化的菌种置于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，在温度55℃，转速120rpm的摇床上振荡培养1天，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按1％的比例接种到发酵罐中的牛肉膏蛋白胨培养液中进行发酵生产，发酵罐的基本工作参数设置为:温度为55℃，ph为6.6
‑
7.2，通气量为0.3v/v
·
min，罐压:0.04mpa，搅拌转速200转/分钟，发酵24h后，取发酵液检测，当od
600
≥1.5，终止发酵，得到发酵液；
49.2)将发酵液以约6000r/min离心10min，取沉淀物用无菌水稀释得到活菌浓度≥109cfu/ml的菌液；
50.3)将木屑、餐厨垃圾按照质量比为100:20制成固体发酵培养基载体，将菌液与载体按照质量比为5:100，搅拌混合均匀，放置于发酵箱中，室温(约25℃)条件下，进行固体发酵，培养时间48
‑
72h，检测有效活菌数≥108cfu/g，停止发酵，得到菌剂，控制菌剂含水率在10％左右。
51.实施例3
52.一种菌剂，包括海内氏芽孢杆菌和载体，海内氏芽孢杆菌的保藏编号为gdmcc61610，载体包括木屑和餐厨垃圾。
53.所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
54.1)将海内氏芽孢杆菌的纯菌种接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，在45℃下培养至长满整个斜面培养基，取活化的菌种置于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，在温度50℃，转速150rpm的摇床上振荡培养1天，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按5％的比例接种到发酵罐中的牛肉膏蛋白胨培养液中进行发酵生产，发酵罐的基本工作参数设置为:温度为50℃，ph为6.6
‑
7.2，通气量为0.6v/v
·
min，罐压:0.05mpa，搅拌转速100转/分钟，发酵24h后，取发酵液检测，当od
600
≥1.5，终止发酵，得到发酵液；
55.2)将发酵液以约6000r/min离心20min，取沉淀物用无菌水稀释得到活菌浓度≥109cfu/ml的菌液；
56.3)将木屑、餐厨垃圾按照质量比为100:25制成固体发酵培养基载体，将菌液与载体按照质量比为0.1:100，搅拌混合均匀，放置于发酵箱中，室温(约25℃)条件下，进行固体
发酵，培养时间48
‑
72h，检测有效活菌数≥108cfu/g，停止发酵，得到菌剂，控制菌剂含水率在10％左右。
57.实施例4
58.一种菌剂，包括海内氏芽孢杆菌和载体，海内氏芽孢杆菌的保藏编号为gdmcc61610，载体包括木屑和餐厨垃圾。
59.所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
60.1)将海内氏芽孢杆菌的纯菌种接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，在65℃下培养至长满整个斜面培养基，取活化的菌种置于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，在温度65℃，转速200rpm的摇床上振荡培养2天，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按10％的比例接种到发酵罐中的牛肉膏蛋白胨培养液中进行发酵生产，发酵罐的基本工作参数设置为:温度为65℃，ph为6.6
‑
7.2，通气量为0.5v/v
·
min，罐压:0.06mpa，搅拌转速400转/分钟，发酵24h后，取发酵液检测，当od
600
≥1.5，终止发酵，得到发酵液；
61.2)将发酵液以约6000r/min离心30min，取沉淀物用无菌水稀释得到活菌浓度≥109cfu/ml的菌液；
62.3)将木屑、餐厨垃圾按照质量比为100:30制成固体发酵培养基载体，将菌液与载体按照质量比为10:100，搅拌混合均匀，放置于发酵箱中，室温(约25℃)条件下，进行固体发酵，培养时间48
‑
72h，检测有效活菌数≥108cfu/g，停止发酵，得到菌剂，控制菌剂含水率在10％左右。
63.实施例5
64.一种餐厨垃圾生物干化的方法，包括以下步骤:
65.餐厨垃圾的组成：食堂剩下的饭菜，沥去汤汁，并去除塑料或骨头等大块、坚硬的部分。餐厨垃圾4661.2g，含水率为79％，加入水分调节剂1500g及200g实施例2制得的菌剂，搅拌均匀，物料总重a为6361.2g，物料含水率w
a
为63.06％。将物料移入发酵箱中进行好氧生物干化，保持氧气含量为8％，约2天翻堆1次。发酵24h时，堆体温度达到58℃，72h可达到最高温度64℃，堆体在50℃高温下维持7d(温度变化如图4所示)，8天后，物料总重b为3310.4g，含水率w
b
降至34.93％(含水率变化如图5所示)，终止发酵，水分质量减重率高达71.18％。
66.本发明通过测定物料的水分质量减重率评价生物干化效果，计算方法如下：
67.水分质量减重率(％)＝((a
×
w
a
‑
b
×
w
b
)/(a
×
w
a
)
×
100％；其中，a为处理前物料总重(g)；b为处理后物料总重(g)；w
a
为处理前物料含水率(％)，w
b
为处理后物料含水率(％)。
68.实施例6
69.一种餐厨垃圾生物干化的方法，包括以下步骤:
70.餐厨垃圾的组成：食堂剩下的饭菜，沥去汤汁，并去除塑料或骨头等大块、坚硬的部分。餐厨垃圾2735g，含水率为80％，加入水分调节剂1358g及200g实施例3制得的菌剂，搅拌均匀，物料总重a为4293g，物料含水率w
a
为58.32％。将物料移入发酵箱中进行好氧生物干化，保持氧气含量为8％，约2天翻堆1次。发酵25h时，堆体温度达到最高温度67℃，堆体在50℃高温下维持5d(温度变化如图6所示)，6天后，物料总重b为1992g，含水率w
b
降至25.29％(含水率变化如图7所示)，终止发酵，水分质量减重率高达79.88％。
71.本发明通过测定物料的水分质量减重率评价生物干化效果，计算方法同实施例5。
72.实施例7
73.一种餐厨垃圾生物干化的方法，包括以下步骤:
74.餐厨垃圾的组成：食堂剩下的饭菜，沥去汤汁，并去除塑料或骨头等大块、坚硬的部分。餐厨垃圾2009g，含水率为80％，加入水分调节剂1419g及200g实施例4制得的菌剂，搅拌均匀，物料总重a为3628g，物料含水率w
a
为53.17％。将物料移入发酵箱中进行好氧生物干化，保持氧气含量为8％，约2天翻堆1次。发酵8h时，堆体温度达到50℃，80h达到了最高温度69℃，堆体在50℃高温下维持6d(温度变化如图8所示)，7天后，物料总重b为1563g，含水率w
b
降至26.49％(含水率变化如图9所示)，终止发酵，水分质量减重率高达78.54％。
75.本发明通过测定物料的水分质量减重率评价生物干化效果，计算方法同实施例5。
76.实施例8
77.一种餐厨垃圾生物干化的方法，包括以下步骤:
78.餐厨垃圾的组成：食堂剩下的饭菜，沥去汤汁，并去除塑料或骨头等大块、坚硬的部分。餐厨垃圾1544g，含水率为80％，加入水分调节剂1311g及200g实施例2制得的菌剂，搅拌均匀，物料总重a为3055g，物料含水率w
a
为50.62％。将物料移入发酵箱中进行好氧生物干化，保持氧气含量为8％，约2天翻堆1次。发酵8h时，堆体温度达到50℃，32h达到了最高温度65℃，堆体在50℃高温下维持6d(温度变化如图10所示)，6天后，物料总重b为994g，含水率w
b
降至29.48％(含水率变化如图11所示)，终止发酵，水分质量减重率高达81.05％。
79.本发明通过测定物料的水分质量减重率评价生物干化效果，计算方法同实施例5。
80.实施例9
81.一种餐厨垃圾生物干化的方法，包括以下步骤:
82.餐厨垃圾的组成：食堂剩下的饭菜，沥去汤汁，并去除塑料或骨头等大块、坚硬的部分。餐厨垃圾1739g，含水率为80％，加入水分调节剂1975g及200g实施例4制得的菌剂，搅拌均匀，物料总重a为3914g，物料含水率w
a
为45.18％。将物料移入发酵箱中进行好氧生物干化，保持氧气含量为8％，约2天翻堆1次。发酵8h时，堆体温度达到50℃，24h达到了最高温度67℃，堆体在50℃高温下维持6d(温度变化如图12所示)，6天后，物料总重b为1429g，含水率w
b
降至26.18％(含水率变化如图13所示)，终止发酵，水分质量减重率高达78.84％。