一株高产胞外多糖的鼠李糖乳杆菌及其在缓解皮肤损伤中的应用的制作方法

1.本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株高产胞外多糖的鼠李糖乳杆菌及其在缓解皮肤损伤中的应用。


背景技术：

2.人体皮肤主要包含表皮层和真皮层2层组织。辐照到人体皮肤的太阳紫外线含有90-99％uva和1-10％的uvb。在相同剂量下，uvb对皮肤的损伤程度比uva高1000倍。并且uvb主要作用于表皮层的角质细胞(hacat)，引发细胞内蛋白、dna和膜脂的损伤，造成代谢紊乱引起皮肤的光损伤，严重者造成皮肤癌。使用传统的防晒霜抗紫外可能会引起皮肤炎症和过敏等副作用。因此利用植物、动物和微生物产生的天然产物进行抗紫外作用受到了关注。目前已有研究发现天然类黄酮水飞蓟素通过上调er alpha和er beta蛋白途径，保护细胞免受uvb损伤；海藻糖通过抑制mmp的表达来抵抗uvb诱导的皮肤老化；来自成团泛菌的胞外多糖能够保护hacat细胞免受uvb的损伤。
3.乳酸菌是普遍存在的益生菌，被认为是“一般安全菌”，其已广泛用于食品、药品和化妆品等领域。乳酸菌能够产生有机酸、抗菌肽、胞外多糖等天然代谢产物。乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide，eps)指的是乳酸菌在其生长以及代谢的过程中产生并且分泌到细胞壁外部的大分子，主要是依附细胞壁的荚膜多糖和进入发酵液中的黏液多糖。近些年的研究发现，乳酸菌及其胞外多糖在抗肿瘤，抗炎，调节免疫和抗菌等方面具有很好的应用效果。乳酸菌及其胞外多糖在抗紫外损伤方面的功能研究也是本领域的一个热点。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株新型鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)及其应用。所述的鼠李糖乳杆菌高产胞外多糖，具有良好的抗氧化活性，并且能够有效抑制皮肤分泌促炎症反应细胞因子，缓解紫外线uvb对皮肤的损伤，效果显著。
5.本发明一方面提供了一种鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌vhprobi o17(lactobacillus rhamnosus vhprobi o17)，已于2021年5月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2021589。
6.本发明一方面提供了鼠李糖乳杆菌vhprobi o17在在制备用于预防和缓解皮肤损伤的制品中的应用。
7.所述的制品为化妆品。
8.本发明一方面提供了鼠李糖乳杆菌vhprobi o17在生产胞外多糖中的应用。
9.本发明还提供了一种胞外多糖，是以鼠李糖乳杆菌vhprobi o17为发酵菌株生产获得的。
10.所述的胞外多糖由d-氨基半乳糖盐酸盐、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖6种单糖组成，其摩尔比为0.05：0.03：0.09：0.05：0.19：1.98。
11.所述的胞外多糖含有β-吡喃甘露糖。
12.所述的胞外多糖的分子量为82.4kda。
13.本发明还提供了所述胞外多糖在制备用于预防和缓解皮肤损伤的制品中的应用。
14.本发明还提供了一种化妆品，包含有鼠李糖乳杆菌vhprobi o17和/或鼠李糖乳杆菌vhprobi o17发酵生产的胞外多糖。
15.本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17具有很强的抗氧化活性，对dpph和羟自由基的清除率分别达到51.73％和26.04％。
16.鼠李糖乳杆菌vhprobi o17对皮肤细胞无毒性影响，还具有一定的促生长作用，能有效缓解uvb辐照对于细胞的损伤。经灭活的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17预处理后的hacat细胞，再被uvb辐照后，其活力下降幅度明显减小。其中，当菌量为8
×
108cfu/ml时，hacat细胞被uvb辐照后的活性比不加菌预处理时提高了76.6％。该菌株还能显著抑制uvb诱导细胞分泌产生促炎症反应细胞因子il-6和il-8，il-6和il-8的分泌量分别降低了34.4％和54.2％，取得了意料不到的技术效果。
17.鼠李糖乳杆菌vhprobi o17能产生一种新的胞外多糖op-2，由d-氨基半乳糖盐酸盐、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖6种单糖组成，可以有效缓解uvb对皮肤的损伤。当辐照剂量为15mj/cm2时，不加胞外多糖预处理的hacat细胞经uvb辐照后的活性仅为27.2％，而当胞外多糖op-2的添加量达16mg/ml时，预处理后的hacat细胞经uvb辐照后的活性高达65.7％，效果非常显著。胞外多糖op-2还能有效抑制uvb诱导皮肤细胞分泌il-1α、il-6和il-8 3种细胞因子。胞外多糖op-2预处理后的hacat细胞，再经uvb诱导，其上清液中il-1α含量降低了20％-91％，最低降至6.73pg/ml，il-6和il-8含量也分别降低了67％和23％，取得了意料不到的技术效果。
18.本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17及其所产的胞外多糖可广泛应用于化妆品中，前景广阔。
附图说明
19.图1为菌株o17的菌落图及革兰氏染色图；其中a为菌落图，b为革兰氏染色图；
20.图2为菌株o17的蛋白指纹图；
21.图3为菌株o17的riboprinter指纹图谱；
22.图4为菌株o17的rapd指纹图；
23.图5为菌株o17的rep-pcr指纹图；
24.图6为鼠李糖乳杆菌vhprobi o17缓解uvb对皮肤细胞损伤效果的对比图；
25.图7为鼠李糖乳杆菌vhprobi o17的生长曲线和胞外多糖的产生曲线；
26.图8为鼠李糖乳杆菌vhprobi o17产胞外多糖的deae-μsphere洗脱色谱图；
27.图9为胞外多糖op-2的离子色谱分析图；
28.图10为胞外多糖op-2的红外光谱分析图；
29.图11为胞外多糖op-2的凝胶柱分析图和标准曲线图；其中a为凝胶柱分析图，b为标准曲线图；
30.图12为胞外多糖op-2缓解uvb对皮肤细胞损伤效果的对比图；
31.图13为胞外多糖op-2抑制uvb诱导皮肤细胞因子产生的对比图。
具体实施方式
32.本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
33.下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述。
34.实施例1 高产胞外多糖的菌株筛选
35.配制mrs琼脂培养基：纯水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母提取物5.0g，乙酸钠5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温80 1.0ml，柠檬酸二胺2.0g，碳酸钙20g，七水硫酸镁0.58g，七水硫酸锰0.25g，琼脂15g，调ph 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。
36.将菌种库中保存的200余株乳酸菌分别活化后，接种于mrs平板，37℃培养48h，观察菌株“粘稠”表型并检测菌落被接种环接触时形成丝的长度。最终筛选出一株菌落粘稠度高、拉丝最长的乳酸菌，命名为o17。
37.实施例2 菌株鉴定
38.2.1菌落形态鉴定
39.将菌株o17接种于mrs琼脂培养基上，37℃培养48h后，可见o17单菌落光滑，呈灰白色，显微镜下为短棒状，两端平齐，o17单菌落及光学显微镜下照片见图1。
40.2.2 maldi-tof-ms检测菌株的全蛋白表达
41.按照0.1％的接种量在mrs液体培养基中接种新鲜菌液，37℃，150rpm培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μl裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μl基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光辐照样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20kv电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测不同分子量蛋白质。利用软件autof acquirer v2.0.59完成数据分析，菌株o17在m/z 2946.082，3476.573，3791.097，4692.724，5892.635，6953.051，7581.626，9382.474等处有明显的离子峰，结果如图2所示。数据比对分析后发现菌株o17与鼠李糖乳杆菌的蛋白表达相似性最高。
42.2.3分子生物学鉴定
43.2.4.1 16s rdna序列分析
44.1、基因组dna提取
45.参照天根细菌基因组dna提取试剂盒(目录号：dp302)操作。
46.2、16s rdna基因扩增
47.1)引物序列：
48.27f：agagtttgatcctggctca；
49.1492r：ggttaccttgttacgactt。
50.2)反应体系(50μl)
51.表2：16s rdna pcr扩增体系表
[0052][0053]
3)电泳验证pcr产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。
[0054]
4)pcr产物测序
[0055]
通过测序获得o17菌株的16s rdna序列seq id no:1，并将该序列在ncbi数据库中进行比对。结果显示seq id no:1与鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)的相似性最高，因此，初步确定o17菌株为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)。
[0056]
seq id no:1：
[0057]
ctcgctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatacaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggttaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaattaaatcaagatgcaagcacctttcaataatcagaactcgttcgactgc。
[0058]
2.4.2 riboprinter指纹图谱
[0059]
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入riboprinter系统中，样品经过dna制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到菌株o17的
riboprinter指纹图谱(图3)。
[0060]
2.4.3 rapd和rep-pcr指纹图谱鉴定
[0061]
1、rapd指纹图谱鉴定
[0062]
1)引物序列：m13(5
’‑
gagggtggcggttct-3’)；
[0063]
2)rapd反应体系
[0064]
表3 rapd反应体系
[0065][0066]
3)电泳
[0067]
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，dl2000 dna marker作为结果对照，稳压100v电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。菌株o17的rapd指纹图谱如图4所示。
[0068]
2、rep-pcr指纹图谱
[0069]
1)rep-pcr引物
[0070]
ctacggcaaggcgacgctgacg。
[0071]
2)rep-pcr的反应体系
[0072]
表4 rep-pcr的反应体系
[0073][0074]
3)电泳
[0075]
dl2000 dna marker作为结果对照。电压100v，电泳时间80min检测扩增结果。菌株o17的的rep-pcr指纹图谱如图5所示。
[0076]
综上，结合o17菌株的菌落形态特征，蛋白指纹图谱，以及分子生物学鉴定结果，可
以得出结论，本发明提供的o17菌株为一株新的鼠李糖乳杆菌，并将其命名为鼠李糖乳杆菌vhprobi o17(lactobacillus rhamnosus vhprobi o17)。
[0077]
实施例3 鼠李糖乳杆菌vhprobi o17的抗氧化活性
[0078]
1、菌株清除dpph自由基能力测定
[0079]
1)pbs菌悬液制备
[0080]
将生长状态优良的单菌落接种于3ml的mrs液体培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50ml的mrs液体培养基中，静置培养24h，获得菌株的培养液。吸取1ml菌液收集菌体后用1mlpbs缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2mlpbs溶液重悬菌体备用。
[0081]
2)菌株清除dpph自由基能力的测定
[0082]
取1ml待测菌株的pbs菌悬液，加入1ml 0.4mm的现配的dpph自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度a样品，测3次平行。对照组样品以等体积pbs溶液和dpph
·
乙醇混合液，并以等体积pbs菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(a
样品-a
空白
)/a
对照
]
×
100％。
[0083]
2、菌株清除羟自由基能力的测定
[0084]
将100ul 5mm的水杨酸钠-乙醇溶液，100ul 5mm的硫酸亚铁，500μl去离子水和200ul乳酸菌psp溶液菌悬液混匀后加入100μl过氧化氢溶液(3mm)，37℃水浴15min后，4000rpm离心10min收集上清在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式进行计算。
[0085]
清除率％＝(a
样品-a
控制
)/(a
空白-a
控制
)
×
100％。
[0086]
其中：a
控制
为硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸钠混合溶液的吸光度，a
空白
为硫酸亚铁和水杨酸钠混合溶液的吸光度。
[0087]
表5抗氧化活性
[0088][0089]
从表5的数据可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17能有效清除dpph和羟自由基，清除率分别达到51.73％和26.04％。从而说明，鼠李糖乳杆菌vhprobi o17具有很强的抗氧化活性，取得了意料不到的技术效果。
[0090]
实施例4 鼠李糖乳杆菌vhprobi o17抗uvb辐射的效果
[0091]
1、hacat细胞培养
[0092]
将hacat角质细胞在含10％(v/v)fbs和1％(v/v)青霉素-链霉素的高糖dmem培养基中进行厌氧培养。培养条件：在二氧化碳培养箱中加有5％(v/v)的二氧化碳，37℃，培养基每3天换一次。
[0093]
2、鼠李糖乳杆菌vhprobi o17对细胞的毒性分析
[0094]
将鼠李糖乳杆菌vhprobi o17接种于100mlmrs培养基中，37℃有氧发酵40h；6000
×
g离心10min，弃上清；将菌体用pbs缓冲液清洗2次；加纯水配制浓度分别为1.6
×
107、8
×
107、4
×
108、2
×
109和1
×
10
10
cfu/ml的菌液；将菌液分别在100℃条件下加热20min，使菌体灭活；将不同浓度的菌液冻干后备用，并分别用等体积的deme培养基溶解。
[0095]
将hacat细胞在24孔板中培养24h，移除培养基；分别加入上述含灭活鼠李糖乳杆菌vhprobi o17(菌量为0，1
×
108，2
×
108，4
×
108，8
×
108和16
×
108cfu/ml)的dmem培养基，孵育2h；然后每孔更换为500μl新鲜dmem培养基，培养24h。通过mtt法评估鼠李糖乳杆菌vhprobi o17对细胞的毒性，具体为：在24孔板中每孔加入50μl、3mg/ml的mtt(噻唑蓝)溶液，避光孵育3h；从孔中吸出溶液，并且每孔中加入500μl的二甲亚砜溶解并使用酶标仪在450nm处检测吸光度。
[0096]
3、uvb诱导hacat细胞分泌促炎症细胞因子
[0097]
将hacat细胞在24孔板中培养24h，移除培养基；分别加入上述含灭活鼠李糖乳杆菌vhprobi o17(菌量分别为0，1
×
108，2
×
108，4
×
108，8
×
108cfu/ml)的dmem培养基，孵育2h；吸出培养基，每孔中加入150μl pbs缓冲液；使用紫外灯辐照，紫外强度为250μw/cm2，辐照剂量为15mj/cm。用dmem培养基培养24h后，通过mtt法检测细胞活性。以未被紫外辐照和鼠李糖乳杆菌vhprobi o17预处理的hacat细胞作对照。
[0098]
4、细胞因子分析
[0099]
取上述经紫外辐照后的细胞培养上清液，利用elisa试剂盒分别检测促炎症反应细胞因子白细胞介素-6(il-6)和白细胞介素-8(il-8)的浓度，参考操作指示进行。结果如图6所示。
[0100]
由图6的结果可知，在菌量≤8
×
108cfu/ml时，灭活的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17对hacat细胞生长无抑制作用；在2
×
108～8
×
108cfu/ml范围内，随着菌量的增加，灭活的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17对细胞生长有一定的促进作用(图6a)。
[0101]
uvb辐照后，hacat细胞的活性均得到不同程度的下降。但经灭活的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17预处理后的hacat细胞，再被uvb辐照后，其活力下降幅度明显减小。其中，当菌量为8
×
108cfu/ml时，hacat细胞经uvb辐照后的活性比不加菌预处理时提高了76.6％(图6b)。
[0102]
此外，用灭活的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17预处理可以显著抑制uvb诱导hacat细胞分泌促炎症反应细胞因子il-6和il-8。经uvb辐照后，hacat细胞培养上清液中il-6和il-8含量急剧增加，最高达到478.41pg/ml和522.583pg/ml；但用菌量为8
×
108cfu/ml的灭活鼠李糖乳杆菌vhprobi o17预处理后，il-6和il-8产生量大幅减少，分别降低了34.4％和54.2％(图6c，6d)。
[0103]
综上所述，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17对细胞没有毒性，且能有效缓解uvb辐照对于细胞的损伤，取得了意料不到的技术效果。
[0104]
实施例5 鼠李糖乳杆菌vhprobi o17产胞外多糖的制备
[0105]
1、胞外多糖的制备
[0106]
将活化后的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17接种于100ml mrs培养基中，37℃培养56h，每8h取5ml菌液，6000
×
g离心10min，得到上清液。将上清液分别用1000da透析袋透析48h，每12h更换一次纯水。透析完成后用苯酚-硫酸法检测胞外多糖的含量。结果如图7所示，鼠李糖乳杆菌vhprobi o17在32h时达到稳定期，在40h时胞外多糖产量达到最大值，为0.603mg/ml。
[0107]
2、胞外多糖的分离提取
[0108]
将鼠李糖乳杆菌vhprobi o17接种于1l的mrs培养基中，37℃有氧发酵40h，6000
×
g离心10min，得到上清液。将上清液减压浓缩5倍，再加入2倍体积的冷的无水乙醇，4℃静置过夜；12000
×
g离心15min，得到粗多糖沉淀；重复醇沉步骤1次。将粗多糖沉淀加纯水溶解后加入4％(w/v)的三氯乙酸，4℃静置2h后，8000
×
g离心15min，除去蛋白。除蛋白后，用6mol/l的naoh调溶液的ph为4，避免多糖在低ph环境下降解，再加入2倍体积的冷的无水乙醇并静置过夜，12000
×
g离心15min得到粗多糖。将得到的粗多糖溶解后用1000da透析袋透析48h，每12h更换一次纯水，透析结束后用1mol/l的naoh调溶液的ph为6.5。
[0109]
透析后的溶液接入填有deae-μsphere填料的层析柱中(1.2
×
11.4cm)，多糖用纯水和不同浓度的nacl分步洗脱(0.05，0.1，0.2，0.4，0.6m)，流速为1ml/min，之后按每管5ml收集洗脱液，并用苯酚-硫酸法检测每管在490nm的吸光度；合并含多糖的收集管，样品透析后冻干浓缩用于下一步研究。
[0110]
结果如图8所示：0.1m nacl洗脱下来的胞外多糖活性最佳，量最多，记为op-2。
[0111]
实施例6 鼠李糖乳杆菌vhprobi o17产胞外多糖的结构表征
[0112]
1)单糖组成
[0113]
在密闭管中，将约5mg的胞外多糖op-2样品在105℃下用2m三氟乙酸水解6h并用氮气干燥样品。之后加入甲醇洗涤并吹干，重复洗涤3次。将残余物重新溶解在去离子水中，并通过0.22μm微孔滤膜过滤后，使用ics5000离子色谱检测分析。色谱参数：采用dionex
tm
carbopac
tm
pa10(250
×
4.0mm，10um)液相色谱柱；进样量为5ul。流动相a(0.1m naoh)，流动相b(0.1m naoh，0.2m naac)，流速0.5ml/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min a/b(95:5，v/v)，30min a/b(80：20v/v)，30.1min a/b(60：40v/v)，45min a/b(60：40v/v)，45.1min a/b(95：5v/v)，60min a/b(95：5v/v)。最后利用软件chromeleon 7.2进行色谱数据分析，结果如图9所示。
[0114]
2)红外光谱分析
[0115]
将干燥的2mg胞外多糖op-2与200mg kbr粉末混合，研磨均匀并压片。ft-ir spectrometry被用于样品的红外扫描，波长范围4000-400cm-1
。记录红外光谱图，如图10所示。
[0116]
3)分子量
[0117]
将胞外多糖op-2配制成5mg/ml溶液，12000
×
g离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。20ul的样品被注射入高效液相色谱仪中进行分析，色谱仪带有一根brt105-104-102串联凝胶柱和示差检测器。根据标准品(分子量：1152，5000，11600，23800，48600，80900，148000，273000，409800，667800da)曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小，如图11所示。
[0118]
从色谱分析结果可知，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17产生的胞外多糖op-2由d-氨基半乳糖盐酸盐、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖6种单糖组成，摩尔比为0.05：0.03：0.09：0.05：0.19：1.98。红外光谱扫描结果显示，胞外多糖op-2存在β-吡喃甘露糖。另外，通过凝胶柱分析发现，胞外多糖op-2的分子量为82.4kda。
[0119]
上述结果显示，鼠李糖乳杆菌vhprobi o17产生的胞外多糖op-2与已知的胞外多糖相比，结构组成均不相同，因此该多糖是一种新的乳酸菌胞外多糖。
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实施例7 胞外多糖op-2对hacat细胞的影响
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1、hacat细胞培养
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参考实施例4。
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2、胞外多糖op-2对细胞的毒性
[0124]
将hacatt细胞在24孔板中培养24h，移除培养基，再分别加入含0，0.5，1，2，4，8，16mg/ml纯化的胞外多糖op-2的dmem培养基，孵育2h；然后每孔更换为500μl的新鲜dmem培养基培养24h。细胞培养结束后，通过倒置显微镜观察细胞形态，采用mtt法评估胞外多糖op-2对hacat细胞的毒性。
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从图12a的结果可知，经胞外多糖op-2处理后的hacat细胞活性没有明显下降，从而说明胞外多糖op-2对hacat细胞没有毒性影响。
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3、uvb诱导hacat细胞
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将在24孔板中培养24h的hacat细胞先在分别含0、1、2、4、8和16mg/ml胞外多糖op-2的dmem培养基中孵育2h；然后吸出培养基，每孔中加入150μl pbs缓冲液；使用紫外灯辐照，紫外强度为250μw/cm2，辐照剂量分别为7.5，15和30mj/cm2。辐照后，将hacat细胞在dmem培养基中继续培养24h后，采用mtt法检测细胞活性。以未被紫外辐照和胞外多糖op-2预处理的hacat细胞作对照。
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从图12b，12c，12d的结果可知，uvb辐照可以显著降低hacat细胞的活性，但经胞外多糖op-2预处理后，uvb对细胞的损伤被缓解。当辐照剂量为15mj/cm2时，不加胞外多糖预处理的hacat细胞经uvb辐照后的活性仅为27.2％，而当胞外多糖op-2的添加量达16mg/ml时，预处理后的hacat细胞经uvb辐照后的活性高达65.7％，取得了意料不到的技术效果。
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4、细胞因子分析
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取上述辐照剂量为15mj/cm2的hacat细胞上清液，利用elisa试剂盒分别检测其中四种促炎症细胞因子il-1α，il-1β，il-6，il-8的浓度，结果如图13所示。
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从图13的结果可知，经过uvb诱导后，hacat细胞分泌的促炎症反应因子il-1α、il-6和il-8急剧增多，而炎症因子il-1β的分泌量没有显著变化。而经胞外多糖op-2预处理后的hacat细胞，再经uvb诱导，其分泌il-1α、il-6和il-8均受到一定的抑制。以il-1α为例，uvb诱导后，hacat细胞上清中il-1α的浓度从1.41pg/ml增加到了74.97pg/ml；而通过胞外多糖op-2(1-16mg/ml)预处理后的hacat细胞，再经uvb诱导，其上清液中il-1α含量降低了20％-91％，最低降至6.73pg/ml(图13a)。同样地，il-6和il-8也具有类似的结果，含量分别降低了67％和23％(图13c、13d)，取得了意料不到的技术效果。
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综上所述，本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17具有很强的抗氧化活性，对dpph和羟自由基的清除率分别达到51.73％和26.04％。该菌株对皮肤细胞无毒性影响，还具有一定的促生长作用。鼠李糖乳杆菌vhprobi o17能有效减轻uvb辐照对于细胞的损伤，显著抑制uvb诱导细胞分泌产生促炎症反应细胞因子il-6和il-8，il-6和il-8的分泌量分别降低了34.4％和54.2％。鼠李糖乳杆菌vhprobi o17能产生一种新的胞外多糖op-2，由d-氨基半乳糖盐酸盐、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖6种单糖组成。该胞外多糖可以显著抑制uvb诱导皮肤细胞分泌il-1α、il-6和il-8 3种细胞因子，缓解uvb对皮肤的损伤。本发明提供的鼠李糖乳杆菌vhprobi o17及其所产生的胞外多糖可广泛应用于化妆品中，前景广阔。