一株无色杆菌菌株JD417及其应用

一株无色杆菌菌株jd417及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及无色杆菌菌株jd417及其培养方法和 应用。


背景技术：

2.磺胺类化合物(磺胺类抗生素)被广泛用于人类和动物疾病的预防治疗、水 产养殖业和畜牧业的动物促生长。近年来，随着在地下水、沉积物、土壤甚至食 物中均检测出了不同程度的磺胺类抗生素残留，包括磺胺二甲基嘧啶 (sulfamethazine,sm2)、磺胺嘧啶(sulfadiazine，sdz)、磺胺甲恶唑 (sulfamethoxazole,smx)等在内的磺胺类化合物对环境和人类健康造成的危害 正逐步地引起人们的高度关注。
3.磺胺类抗生素具有环境毒理和环境富集效应，经机体摄入后，大部分会以母 体或代谢物的形式进入环境中。环境中抗生素的长期存在，会诱导生成耐药菌， 加速筛选耐磺胺突变体以及细胞间耐药基因(antibiotics resistance genes，args) 的垂直和水平传递，甚至形成多重耐药的超级细菌，对人类健康造成巨大威胁。
4.目前对抗生素废水的处理方法有很多，包括物理化学法和生物法，如絮凝法、 氧化法、消毒法、电化学法等，物理法如气浮法、超声波法、膜分离法、吸附法 等，这些方法虽然有效、处理效果好，但处理成本较高，容易造成二次污染。传 统的活性污泥法、膜生物法等生物处理法虽然成本低，无二次污染，但由于大部 分抗生素可降解性差，难以被普通微生物彻底降解，其应用受到一定的限制。基 因工程菌虽然能高效专一地降解目标污染物，但往往伴随着生物安全性问题，大 量投入实际环境中应用存在极大的安全隐患。因此，从环境中分离筛选出具有降 解抗生素能力的土著微生物，是微生物修复菌剂的理想材料，将其应用于抗生素 废水的处理，具有能耗及处理费用低、反应条件温和、无二次污染等明显优势， 同时其环境适应性强，具有广泛的定殖能力，可实现良好的生态环境修复效益。
5.另外，污水处理厂处理废水排放的尾水往往存在高硝氮污染，含高浓度的氮 化合物废水会导致水体富营养化，从而影响水生植物和动物的生长，甚至威胁到 饮用水的安全。当在处理畜禽养殖、医疗、制药厂排放的废水时，污水处理厂排 放的尾水存在抗生素与氮化合物的双重污染，如何有效去除两种污染物成为当前 的研究焦点。筛选兼具磺胺去除和脱氮能力功能菌，并将其应用于尾水处理中， 可有效削减废水难降解抗生素及氮的污染，保障污水处理系统的高效运行，实现 良好的生态环境修复效益。
6.目前对无色杆菌(achromobacter sp.)的研究主要集中在其对持久性有机污 染物及重金属的降解或耐受能力，例如专利cn201510066134.8公布一株降解邻 苯二甲酸二异辛酯的无色杆菌achromobacter sp.mt-h，专利cn201410223299.7 公布了一株用于降解多环芳烃类有机污染物的无色杆菌菌株achromobacter sp. w143及其应用，专利cn201910552280.x公布了一株能耐受锌离子毒性的无色 杆菌，专利cn201710474774.1公布了一株兼具六价铬去除和好氧反硝化性能的 无色杆菌(achromobacter sp.)。目前国内仅有一项专利(cn201710474535.6)公 布了耐受磺胺的无色杆菌(achromobacter sp.)对
污水脱氮方面的效果，但是该菌 株只可以在0～20μg/l磺胺类抗生素浓度条件下保持完整的细胞结构，细胞膜不 被破坏，因此应用十分受限。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供耐受高浓度磺胺类化合物(抗生素)的微生物菌，本发 明所提供的耐受高浓度磺胺类化合物为无色杆菌(achromobacter sp.)菌株 jd417，不仅能耐受降解50mg/l磺胺类化合物，而且还能降解氮类物质。该菌 株可以以硝酸盐氮为唯一氮源和以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源维持生存，有效减 少水体中总氮、硝酸盐氮及磺胺类化合物。
8.本发明的目的是提供一株无色杆菌(achromobacter sp.)菌株jd417。
9.本发明的另一目的是提供无色杆菌菌株jd417在防治水体污染方面的应用， 或制备防治水体污染的产品方面的应用，所述的水体污染由总氮、硝酸盐氮和/ 或磺胺化合物造成。
10.本发明的另一目的是提供无色杆菌菌株jd417在降解磺胺类化合物方面的 应用，或制备降解磺胺类化合物产品方面的应用。
11.本发明的另一目的是提供无色杆菌菌株jd417在脱氮方面的应用，或在制备 脱氮产品方面的应用。
12.本发明的另一目的是提供无色杆菌菌株jd417的培养方法。
13.本发明的另一目的是提供一种防治水体污染的菌剂。
14.本发明的另一目的是提供一种防治水体污染的方法。
15.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
16.申请人团队从广东省广州市的药厂污水中，经人工分离纯化获得了一株不仅 能降解磺胺类化合物，而且还能降解氮类物质的菌株。依据菌株的16s rdna的 测序结果，在ncbi数据库中进行blast多重序列比对分析，发现其16srdna的 序列与achromobacter spanius myb73(登录号cp023270.1)同源，具有99％的 相似性。因此，该菌株属于(achromobacter spanius)，命名为jd417。2021 年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 2021813， 保藏地址为中国武汉市武汉大学。
17.菌株jd417形态特征如下：生长最适温度为37摄氏度，在lb平板培养基 上，菌落呈圆形、直径约2～3mm、表面光滑扁平、边缘整齐、淡黄色、不透明， 革兰氏染色呈阳性。扫描电镜下(7000
×
)观察，菌呈小圆柱体状，长度约为1～1.5 μm。
18.研究显示，菌株jd417不仅能降解磺胺类化合物，而且还能降解氮类物质。 因此本发明要求保护：
19.无色杆菌菌株jd417在防治水体污染方面的应用，或制备防治水体污染的产 品方面的应用，所述的水体污染由总氮、硝酸盐氮和/或磺胺化合物造成。
20.无色杆菌菌株jd417在降解磺胺类化合物方面的应用，或制备降解磺胺类化 合物产品方面的应用。
21.其中，优选地，所述的磺胺类化合物为磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡 啶、磺胺醋酰和磺胺甲恶唑。
22.无色杆菌菌株jd417在脱氮方面的应用，或在制备脱氮产品方面的应用。
23.其中，优选地，所述的脱氮是指降解总氮或硝酸盐氮。
24.无色杆菌菌株jd417的培养方法，包括以下步骤：
25.(1)将无色杆菌菌株jd417接种于ph6.5～8.0的培养基中；
26.(2)30～37℃下摇床培养，120～150r/min。
27.所述的培养基内含蛋白胨8～12g/l，酵母提取物4～6g/l，nacl 4.5～5.5g/l， 磺胺二甲基嘧啶10～50mg/l。
28.其中，优选地，所述的ph为7.2。
29.其中，优选地，所述的培养基内含蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 5 g/l。
30.一种防治水体污染的菌剂，其含有所述菌株jd417。
31.一种防治水体污染的方法，在水体中接种所述菌株jd417，所述的水体污染 由总氮、硝酸盐氮和/或磺胺化合物造成。
32.本发明具有以下有益效果：
33.本发明提供了一株无色杆菌(achromobacter sp.)菌株jd417，其：
34.(1)能够耐受高浓度的磺胺类化合物(抗生素)，能够有效降解总氮、硝 酸盐氮和磺胺化合物，成本低；
35.(2)能够用于防治由总氮、硝酸盐氮和磺胺类化合物的引起的水体污染， 具有易操作、能耗低、成本少、反应条件温和无二次污染等优点。
附图说明
36.图1显示无色杆菌菌株jd417形态，其中a为菌株革兰氏染色后在显微镜 下的照片，b为菌落平板状态照片，c为菌株jd417在扫描电镜下的照片。
37.图2显示无色杆菌菌株jd417的系统发育树。
38.图3显示无色杆菌菌株jd417在不同的磺胺二甲嘧啶(sm2)浓度下的细胞 比生长速率。
39.图4显示无色杆菌菌株jd417的反硝化基因pcr产物琼脂糖凝胶电泳条带。
40.图5显示无色杆菌菌株jd417硝酸还原酶narg同源比对。
41.图6显示无色杆菌菌株jd417亚硝酸盐还原酶nirk同源比对。
42.图7显示无色杆菌菌株jd417氧化亚氮还原酶nosz同源比对。
43.图8显示无色杆菌菌株jd417的磺胺二甲基嘧啶、总氮和硝酸盐氮去除率
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时间曲线。
44.图9显示无色杆菌菌株jd417的磺胺二甲嘧啶去除率-时间曲线。
45.图10显示ph、温度、接种量交互影响菌株jd417降解磺胺二甲嘧啶的 box-behnken响应曲面。
46.图11显示菌株jd417对不同磺胺类化合物(50mg/l)的降解效果。
具体实施方式
47.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为 市购。
48.实施例1：菌株的富集、分离和纯化
49.在广东省广州市白云山化学制药厂废水处理曝气池污泥中分离菌株。取50g 污泥放入盛有50ml无菌水的锥形瓶中(内有数颗玻璃珠)，于摇床振荡30min 充分打散泥样。取打散后的悬浮泥样5ml，接种至盛有100ml的液体初筛培养 基中，30～37℃、120～150rpm振荡培养24～48h。所述液体初筛培养基ph 为7.2，组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 5g/l，磺胺二甲基嘧 啶10～50mg/l。
50.随后转移至以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源的液体复筛培养基，逐级驯化培养 3～5次，每次培养时间为36～48h，驯化浓度为10～100mg/l，培养条件为30～37℃、 120～150r/min的摇床中振荡培养。用无菌生理盐水将培养液梯度稀释到10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7。取0.1ml的稀释液涂布于固体复筛培养 基平板上，培养36～48h，挑取不同形态单菌落，在固体复筛培养基平板上多 次划线纯化，直至各培养基平板无杂菌后，挑取各个单菌落待用。
51.实施例2：菌株的筛选
52.采用磺胺二甲基嘧啶降解效率为指标筛选菌株，取各个单菌落于液体筛选培 养基中培养，每隔12～48h测定培养液的磺胺二甲基嘧啶浓度，筛选对磺胺二甲 基嘧啶降解效果最佳的菌株。
53.所述的复筛培养基组成为：na2hpo4·
12h2o 15.58g/l，kh2po
4 675mg/l， mgso4·
h2o 112mg/l，nh4cl 20.4mg/l，feso4·
7h2o 1mg/l，mnso4·
h2o 1 mg/l，cucl2·
2h2o 0.25mg/l，na2moo
4 0.25mg/l，cacl
2 0.015mg/l，sm2 10～ 100mg/l，ph 7.2。所述固体复筛培养基的组分是在液体复筛培养基的基础上 加15g/l琼脂。
54.对磺胺二甲基嘧啶降解效果最佳的菌株命名为jd417。
55.实施例3菌株鉴定
56.1.形态学鉴定
57.菌株jd417为革兰氏阴性菌(图1a)。平板培养中菌落呈圆形、表面光滑 扁平、边缘整齐、淡黄色、不透明、菌落直径约2～3mm(图1b)，扫描电镜 下(7000
×
)观察，菌呈小圆柱体状，长度约为1～1.5μm(图1c)。
58.2.分子学鉴定
59.根据测序结果显示菌株jd417为无色杆菌achromobacter sp.，其16s rdna 序列与achromobacter spanius myb73(登录号cp023270.1)同源，具有99％的 相似性。该菌株的系统发育树见图2。该无色杆菌(achromobacter spanius)菌 株jd417于2021年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m 2021813，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
60.实施例4菌株jd417生长速度和底物磺胺二甲基嘧啶浓度关系
61.将菌株jd417复苏接种于液体富集培养基中，于30～37℃、120～150rpm 下摇床培养24～48h即得所述菌株的培养液；所述液体培养基ph为7.2，组成 为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 5g/l，磺胺二甲嘧啶10～50mg/l。
62.取对数生长期(od
600
＝0.6)的菌株jd417培养液，按5％(v/v)接入 100ml的液体最小无机盐培养基中，分别加入浓度为5～250mg/l的磺胺二甲 基嘧啶，30～37℃培养，每隔12～24h测定培养液的od600吸光值。所述液体 最小无机盐培养基的组成为：na2hpo4·
12h2o 15.58g/l，kh2po
4 675mg/l， mgso4·
h2o 112mg/l，nh4cl 20.4mg/l，feso4·
7h2o 1mg/l，mnso4·
h2o 1 mg/l，cucl2·
2h2o 0.25mg/l，na2moo
4 0.25mg/l，cacl
2 0.015mg/l，ph 7.2。
63.一定浓度的磺胺二甲基嘧啶会对菌株jd417产生毒害作用，使其出现生长抑 制现象，haldane方程可用于菌株jd417在以有毒基质为底物时菌株细胞生长动 力学研究。haldane方程表达式为：
[0064][0065]
表达式中μ：细胞比生长速率(h-1)；μ
max
：细胞最大比生长速率(h-1)； s：底物浓度(mg/l)；ks：饱和常数(mg/l)；ki制常数(mg/l)。
[0066]
结果：如图3所示，经非线性最小二乘拟合，菌株jd417在不同底物磺胺二 甲嘧啶(sm2)浓度下细胞生长速度实验值可用haldane方程进行拟合，菌株 jd417生长抑制动力学方程为
[0067][0068]
动力学参数分别为μmax＝0.088h-1，ks＝90.61mg/l，ki＝28.48mg/l，拟 合曲线r2＝0.962，拟合参数的残差平方和为8.12
×
10-6，因此拟合曲线与实验值 具有良好相关性，拟合得到的参数准确可信。
[0069]
对haldane方程二阶求导并使其值为0，可得参数该研究 中cs＝50.80mg/l，即当磺胺二甲嘧啶的平均浓度为50.80mg/l时，菌株jd417 细胞比生长速率最大，以此点为界线，拟合曲线可分成两个部分，磺胺二甲嘧啶 浓度低于50.80mg/的基质限制性区域和磺胺二甲嘧啶浓度高于50.80mg/的基质 抑制性区域。
[0070]
实施例5验证菌株jd417的反硝化基因
[0071]
菌株jd417复苏接种于液体富集培养基中，于37℃、120rpm下摇床培养24h 即得所述菌株的培养液；用pbs清洗菌体，用细菌基因组试剂盒(magen)提取 菌株jd417的dna。采用pcr技术扩增菌株基因组反硝化功能基因中的硝酸盐 还原酶基因narg、亚硝酸盐还原酶基因nirk、氧化亚氮还原酶基因nosz片段， 扩增反应体系为25μl，包括pcr supermix 12.5μl,正向引物0.5μl，反向引物 0.5μl，dna模板2μl，无菌水9.5μl。扩增程序为：首先94℃变性5min；然后 40个循环，每个循环95℃变性30s，退火温度下保持30s；72℃延伸1min；最后72℃延 伸8min。反硝化功能基因扩增的特异性引物及退火温度如下表1所示。
[0072]
表1
[0073][0074]
结果：如图4所示，所述菌株jd417基因组含反硝化基因narg(硝酸还原酶基因)，nirk(亚硝酸还原酶)，nosz(氧化亚氮还原酶)。所述菌株jd417基因组的反硝化基因narg、nirk、nosz序列与已报道的大多数无色杆菌同类基因高度同源，结果如图5，图6和图7所示，分别与achromobactersp.b4u2b，achromobacterxylosoxidans，achromobactermucicolens同类基因相似性高达99％以上。
[0075]
实施例6菌株jd417降解磺胺二甲基嘧啶和脱氮效果
[0076]
取对数生长期(od
600
＝0.6)的菌株jd417培养液，按5％(v/v)接入100ml的含模拟磺胺高硝氮废水的培养基中，于37℃培养156h，每隔12～24h测定培养液的磺胺二甲基嘧啶浓度、总氮和亚硝酸盐氮。
[0077]
所述模拟磺胺高硝氮废水的培养基的组成为：c6h6o63g/l,na2hpo4·
12h2o15.58g/l，kh2po4675mg/l，mgso4·
h2o112mg/l，nano30.5g/l，feso4·
7h2o1mg/l，mnso4·
h2o1mg/l，cucl2·
2h2o0.25mg/l，na2moo40.25mg/l，cacl20.015mg/l，磺胺二甲基嘧啶1mg/l。培养基ph为7.2。
[0078]
用降解率来考察菌株jd417的磺胺二甲基嘧啶降解及脱氮能力。按照公式计算降解率：
[0079][0080]
其中c0：培养液初始的污染物浓度；c1：培养一段时间后培养液的污染物浓度。
[0081]
磺胺二甲基嘧啶的含量测定：采用液质联用的方法，具体为每次取样1ml，过0.22μm尼龙有机滤膜于2ml棕色样品瓶。色谱条件：色谱柱为venusilc18plus柱(2.1*100mm，3um，120a)；柱温40℃；进样量2ul，流速为0.5ml/min。使用梯度洗脱来优化分离，流动相包括1％。甲酸水(a)和乙腈(b)：80％a(0min)，80％a(3min)，0％a(6min)，0％a(8min)，20％a(8.1min)，20％a(10min)。质谱条件：离子源为esi源正离子模式，气帘气压力为35psi，离子源电压为5500v，干燥气温度为550℃，雾化气压力为50psi，干燥器气压力为50psi。
[0082]
总氮和硝氮的含量测定：参照国家环保局编著《水和废水监测分析方法》(第4版)(国家环境保护局，2002)的方法。
[0083]
结果：如图8所示，菌株jd417在模拟磺胺高硝氮废水中，该菌株能够以硝酸盐氮为唯一氮源，水体总氮、硝氮及磺胺二甲基嘧啶的去除率分别可达40％，80％及70％以上。
[0084]
实施例7菌株jd417对高浓度(50mg/l)的磺胺二甲基嘧啶的动态降解
[0085]
参照实施例2，培养所述菌株，取对数生长期(od
600
＝0.6)的菌株jd417培养液，按5％(v/v)接入100ml的实施例4的液体培养基中，调整磺胺二甲基嘧啶50mg/l，30～37℃培
养，每隔12～48h测定培养液的磺胺二甲基嘧啶 浓度。
[0086]
结果：如图9所示，sm2浓度为50mg/l时降解率在192h时可达到40％以 上。
[0087]
实施例8菌株jd417降解磺胺二甲基嘧啶的优化
[0088]
采用box-behnken响应曲面法优化培养液ph值，菌株接种量和培养温度这 3个因素，以提高菌株jd417对磺胺二甲基嘧啶的降解率。优化因素的水平设置 如下，ph设置为5～9，菌株接种量设置为1～5％，培养温度设置为25～45℃， 具体见表2。
[0089]
表2
[0090][0091]
以磺胺二甲基嘧啶降解率为响应值(y)，经box-bohnken实验设计共得到 17组实验设计。按照表3设计的17组实验参数，将菌株jd417分别接入100ml 含50mg/l磺胺二甲基嘧啶的液体培养基中，培养8天后，取样测定培养液的磺 胺二甲基嘧啶浓度并计算其降解率。
[0092]
表3
[0093]
[0094][0095]
结果：结果如图10所示，综合三个曲面图，可得到菌株jd417最佳的降解 条件参数：ph＝7.39，接种量＝5％，温度＝35.9℃，在该条件下，菌株jd417对培 养液中磺胺二甲基嘧啶的降解率模拟预测值达到最高，为44.75％。
[0096]
实施例9菌株jd417对其他磺胺类化合物的降解效果
[0097]
取对数生长期(od
600
＝0.6)的菌株jd417培养液，按5％(v/v)接入100ml 的液体最小无机盐培养基中，分别加入50mg/l磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺 胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺甲恶唑，于35.9℃培养8d，测定各培养液的磺胺浓度 并计算降解率。
[0098]
结果：如图11所示，菌株jd417对各类磺胺化合物均有一定的降解效果， 降解率在16.46～40.84％，其中，对磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶降解效率最佳， 分别达到36.29％，40.84％。
[0099]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。