1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及马尾藻甾醇合成酶及其制备方法、应用
背景技术：
2.植物甾醇可通过降低胆固醇减少心血管病的风险。此外，植物甾醇具有良好的抗氧性，可作食品添加剂(抗氧化剂、营养添加剂)；也可作为动物生长剂原料，促进动物生长，增进动物健康。因此，植物甾醇被广泛应用于食品、医药、化妆品、动物生长剂等领域。预期至2020年，全球植物甾醇相关的产值将达到十亿美元。
3.马尾藻甾醇属于侧链羟基化植物甾醇(sidechain hydroxylated phytosterols，shp)，具有广泛的生理活性。可用于治疗与肝x受体(liver x receptors，简称lxrs)相关的疾病，如动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病或肿瘤(参见刘红兵等，一种马尾藻甾醇的用途，授权公告号cn102861023b；zhen chen等,24(s)
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saringosterol from edible marine seaweed sargassum fusiforme is a novel selective lxrβagonist,2014,journal of agricultural and food chemistry,62(26),第6130
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6137页)。此外，马尾藻甾醇对结核杆菌、分枝杆菌(参见gerald a wachter等，inhibition of mycobacterium tuberculosis growth by saringosterol from lessonia nigrescens，journal of natural products，2011，64(11),第1463
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1464页)、布氏锥虫(参见sarahoet等，antitrypanosomal activity of triterpenoids and sterols from the leaves of strychnos spinosa and related compounds，2007，journal of natural products，70(8),第1360
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1363页)、肥胖(参见jungalee等，anti
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obesity activity of saringosterol isolated from sargassum muticum(yendo)fensholt extract in 3t3
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l1 cells，2017，phytotherapy research，31(11),第1694
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1701页)、抑郁(参见hongguo jin等，antidepressant
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like effects of saringosterol,a sterol from sargassum fusiforme by performing in vivo behavioral tests，2017，medicinal chemistry research，26(5),第909
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915页)、骨肉瘤(参见gyuwon huh等，fucosterols from hizikia fusiformis and their proliferation activities on osteosarcoma
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derived cell mg63，2012，journal of the korean society for applied biological chemistry，55(4),第551
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555页)、阿耳滋海默氏病(参见bogie,j.,hoeksdietary等，sargassum fusiforme improves memory and reduces amyloid plaque load in an alzheimer's disease mouse model，2019，scientific reports,9(1),第4908页)等具有显著的抑制作用。同时，马尾藻甾醇可作为前体化合物合成各类高值甾体化合物。
4.由于马尾藻甾醇的生物合成机制以及涉及的酶和酶促反应机制，还未完全阐释，因此，无法通过生物合成的方式规模化生产马尾藻甾醇。目前，马尾藻甾醇的生产方式是通过酶介氧化或自氧化的方法，将来源于藻类的异岩藻甾苷或墨角藻甾醇转化为马尾藻甾醇。然而，这种方法具有稳定性差、不易操作的缺点。因此，亟待寻找一种新型的、可规模化放大生产马尾藻甾醇的方法。
技术实现要素：
5.有鉴于此，本发明提供了马尾藻甾醇合成酶及其制备方法、应用。本发明所述的马尾藻甾醇合成酶可一步催化特异底物与s
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腺苷
‑
l
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蛋氨酸(adomet)甲基基团、水分子的羟基基团结合形成马尾藻甾醇，可实现马尾藻甾醇的规模化生产，且操作步骤简单易行。
6.本发明提供了马尾藻甾醇合成酶，其氨基酸序列如seq id no:1所示；或为seq id no:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
7.一些实施方案中，本发明所述的马尾藻甾醇合成酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
8.本发明所述的马尾藻甾醇合成酶来源包括但不限于藻类、植物、锥虫和阿米巴虫。
9.在一个具体实施方案中，本发明提供了以提取的chlamydomonas sp.mem
‑
52 cdna为模板，以引物seq id no:3和seq id no:4所示的序列为引物，pcr扩增，获得具有编码本发明所述马尾藻甾醇合成酶的dna分子，序列如seq id no:2所示。
10.本发明还提供了所述马尾藻甾醇合成酶的制备方法，为：构建含编码所述马尾藻甾醇合成酶的dna分子的重组载体，将所述重组载体转化宿主菌，经诱导表达、分离纯化，获得马尾藻甾醇合成酶。
11.本发明提供的马尾藻甾醇合成酶的制备方法中，所述宿主菌为大肠杆菌。
12.本发明还提供了编码本发明所述马尾藻甾醇合成酶的dna分子，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
13.本发明还提供了含有本发明所述马尾藻甾醇合成酶的dna分子的重组载体。
14.在一些实施方案中，所述重组载体的基础载体为大肠杆菌表达载体或酵母表达载体。其中，大肠杆菌表达载体优选为pet系列载体，更优选为pet
‑
28a载体；酵母表达载体优选为pyes载体。
15.本发明还提供了转化有本发明所述重组载体的宿主菌。
16.在一个具体实施方案中，所述宿主菌为大肠杆菌。在一个实施方案中，所述宿主菌为酵母菌，优选为酿酒酵母。
17.本发明还提供了本发明所述马尾藻甾醇合成酶在制备马尾藻甾醇中的应用。
18.本发明还提供了马尾藻甾醇的制备方法，包括体外合成法和体内生物合成法。
19.其中，体内生物合成法包括：
20.构建含seq id no:2所示dna分子的重组载体，将所述重组载体转化宿主菌，诱导表达，离心收集菌体，提取马尾藻甾醇。
21.在一些实施方案中，所述宿主菌为积累甾体化合物的宿主菌。其中，甾体化合物包括但不仅限于侧链具有共轭双键的甾体化合物，在一些具体实施方案中，甾体化合物为24(28)
‑
去氢麦角甾醇。宿主菌包括但不仅限于酵母菌，在一些具体实施方案中，所述宿主菌为酿酒酵母。在一个具体实施例中，所述宿主菌为积累24(28)
‑
去氢麦角甾醇的酿酒酵母，即积累24(28)
‑
去氢麦角甾醇的酵母突变株δergx。
22.在一个具体实施方案中，所述体内生物合成包括如下步骤：
23.构建含seq id no:2所示dna分子的重组载体，将所述重组载体转化积累24(28)
‑
去氢麦角甾醇的酿酒酵母突变株δergx，经诱导培养基诱导表达后，离心收集菌体，提取马尾藻甾醇。
24.其中，所述ypd培养基配方为：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l。如果制备固体培养剂，在高压灭菌前加入终浓度为2％的琼脂。
25.基本培养基配方为：0.67％yeast nitrogen base(ynb)，2％葡萄糖，0.074％do supplement(
‑
ura)，低压灭菌。
26.诱导培养基为：0.67％yeast nitrogen base(ynb)，2％半乳糖，1％棉子糖，0.074％do supplement(
‑
ura)，低压灭菌。
27.体外合成法包括：甾体化合物、s
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腺苷
‑
l
‑
蛋氨酸和水经权利要求1所述的马尾藻甾醇合成酶催化，获得马尾藻甾醇。
28.在一些实施方案中，甾体化合物的侧链具有共轭双键。
29.本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果：
30.(1)本发明发现了一种依赖于马尾藻甾醇合成酶的马尾藻甾醇的合成机制，完全不同于已知的依赖于羟基化酶的其它shps合成途径。该机制的阐释，为利用绿色的酶学方法、代谢工程方法和合成生物学手段规模化制备马尾藻甾醇提供了理论支撑和技术平台。
31.(2)将本发明所述的马尾藻甾醇合成酶基因转化积累24(28)
‑
去氢麦角甾醇的酵母，可用于规模化生产马尾藻甾醇，为在其它物种中生产马尾藻甾醇的代谢改造和采用合成生物学手段优化生产效率提供了参考依据。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
33.图1为本发明涉及的合成马尾藻甾醇的物种中代表性甾醇的化学结构式；1.墨角藻甾醇；2.胆固醇；3.24(s)
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saringosterol；4.24(r)
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saringosterol；5.麦角固醇；6.stigmasta
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5,7,22
‑
tien
‑
3,24(s)
‑
diol；and8.stigmasta
‑
5,7,22
‑
tien
‑
3,24(r)
‑
diol；
34.图2为本发明发现的马尾藻甾醇合成酶合成催化机制；
35.图3为本发明使用转化载体构建示意图；
36.图4为表达有马尾藻甾醇合成酶的酵母工程细胞的代谢物gc
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ms检测；e
‑
1,ergosta
‑
5,7,22,24(28)
‑
tetraenol，e
‑
2,stigmasta
‑
5,7,22
‑
tien
‑
3,24(s)
‑
diol，和e
‑
3,partialmassofstigmasta
‑
5,7,22
‑
tien
‑
3,24(r)
‑
diol。
具体实施方式
37.本发明公开了马尾藻甾醇合成酶及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
38.本发明提供的马尾藻甾醇合成酶及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
39.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
40.实施例1本发明所述马尾藻甾醇合成酶发现种的甾体化合物图谱分析
41.将所述马尾藻甾醇合成酶发现种命名为mem
‑
52接种于培养基中，培养至对数生长期。收集细胞后，真空冷冻干燥，提取总脂后gc
‑
ms分析甾体化合物组成。甾体化合物提取方法参照lu等，regulation of the cholesterol biosynthetic pathway and its integration with fatty acid biosynthesis in the oleaginous microalga nannochloropsis oceanic,2014,biotechnology for biofuels,7:81。采用agilent6890n气相色谱仪检测，ffap柱子，分流比：20∶1；进样口温度：250℃；柱温：150℃
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230℃程序升温；检测器温度：250℃；气化室温度：350℃；尾吹：40ml/min；氢气流速：45ml/min；空气流速：450ml/min；检测器：氢火焰离子化检测器(fid)；进样量：1μl，具体操作参照按仪器操作说明书进行操作(zhou w等，cholesterol import fails to prevent catalystbased inhibition of ergosterol synthesis and cell proliferation of trypanosoma brucei.j lipid res2007,48:第665
–
673页)。
42.实施例2马尾藻甾醇体外酶促反应及检测
43.设计并合成如下引物seq id no:3和seq id no:4。
44.seq id no:3：atggcagttgctttgcccgc；
45.seq id no:4：tttttttttatcagcacctgg。
46.将mem
‑
52培养至对数生长期，提取rna，反转录获得cdna，经引物seq id no:1和seq id no:2进行pcr扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 7min延伸。pcr扩增产物为马尾藻甾醇合成酶基因(saringosterol synthase,ss)，纯化pcr产物，连接于pet
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28a载体，获得pet
‑
28a
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ss。将上述连接产物通过热击转化转入感受态细胞e.colibl21，涂布于lb筛选平板(含50μg/ml卡那霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑出单克隆，采用引物seq id no:3和seq id no:4验证，获得阳性克隆，命名为e.coli
‑
ss工程细胞。
47.将阳性e.coli
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ss克隆涂布于从平板(含50μg/ml卡那霉素)上活化。挑取单克隆接种到250ml三角瓶的50ml lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph 7.0)中，于28℃，200rpm条件下摇菌发酵。培养至对数期后，离心收集细胞，去除上清，采用磷酸钠缓冲液(50mm,ph 8.0)清洗细胞3次。重悬于磷酸钠缓冲液，超声波破碎细胞，获得细胞匀浆，4℃保存待用。
48.制备24(28)
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去氢麦角甾醇化合物，采用dmso将24(28)
‑
去氢麦角甾醇化合物溶解至1mg/ml。
49.向100μl上述制备的细胞匀浆中加入1mm 24(28)
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去氢麦角甾醇溶液。同时设置向细胞匀浆中加入dmso的反应液作为对照组。25℃反应过夜。
50.反应结束后，涡旋震荡，于室温静置20分钟后，加入丁酮进行萃取，然后静置分层。待丁酮萃取液与水相分离后，吸取上清萃取液用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行气相色谱
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质谱(gc
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ms)检测。
51.甾体化合物提取和测定方法参照lu等，regulation of the cholesterol biosynthetic pathway and its integration with fatty acid biosynthesis in the oleaginous microalga nannochloropsis oceanic,2014,biotechnology for biofuels,7:81。结果如图2所示，野生菌产生化合物为24(28)
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去氢麦角甾醇。而e.coli
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ss工程细胞中则产生了马尾藻甾醇。
pathway and its integration with fatty acid biosynthesis in the oleaginous microalga nannochloropsis oceanic,2014,biotechnology for biofuels,7:81。采用agilent6890n气相色谱仪检测，ffap柱子，分流比：20∶1；进样口温度：250℃；柱温：150℃
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230℃程序升温；检测器温度：250℃；气化室温度：350℃；尾吹：40ml/min；氢气流速：45ml/min；空气流速：450ml/min；检测器：氢火焰离子化检测器(fid)；进样量：1μl，具体操作参照按仪器操作说明书进行操作(zhou w等，cholesterol import fails to prevent catalystbased inhibition of ergosterol synthesis and cell proliferation of trypanosoma brucei.j lipid res 2007,48:第665
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673页)。结果如图4所示，s.cerevisiae
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ss生产含有马尾藻甾醇的化合物e2和e3。
61.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。