抗CA724抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用与流程

抗ca724抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用
技术领域
1.本技术属于免疫技术领域，尤其涉及抗ca724抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。


背景技术：

2.ca724是近几年临床常用的一个肿瘤指标，主要用于消化道肿瘤的早期筛查，属于非特异性肿瘤标志物。其本质是细胞表面黏蛋白类的高分子糖蛋白，广泛分布于上皮细胞和恶性肿瘤的细胞质内，相对分子质量为(220
‑
400)
×
103，可被cc49和b72.3两种单克隆抗体识别。ca724是构成肿瘤细胞骨架成分的重要分子结构，分子结构中含有磷酸化的氨基酸序列，随着肿瘤细胞的异常增殖，可通过外分泌的方式释放入血液循环，正常人体血清中ca724<6u/ml，当组织发生癌变，则可迅速入血，血清检测水平急剧升高。因此，ca724又属于癌胚抗原性质肿瘤标志物。
3.目前，研究中所提供的有关ca724的检测方法主要是电化学发光法，检测仪器多源自罗氏elecsys1010、2010、170和601免疫测定分析仪。目前多采用cc49和b72.3两种单克隆抗体检测ca724，后者是 ca724的特异性抗体，利用抗原抗体夹心法的原理，对ca724水平进行检测。
4.胃癌的检测目前没有一个特异性的肿瘤指标，需依靠病理和手术进行诊断。ca724是现有与胃癌相关性最高的一个指标。ca724在胃癌患者中血清水平远远大于胃部良性病变患者和健康人群，对胃癌有较大的诊断参考价值。ca724对胃癌诊断特异度优于其他指标，如 ca199和cea等。ca724在卵巢癌、非小细胞肺癌患者血清中水平也呈明显升高，同时对于肝癌和结直肠癌份的分级诊断有较大的参考价值。因此，对ca724的检测有较大的临床意义。
5.目前国内用于检测ca724的单克隆抗体基本自外国采购，灵敏度、特异性上都存在缺陷，因此，有需要提供更多的ca724单克隆抗体。


技术实现要素：

6.为解决现有技术中ca724抗体可选择性不够、灵敏度和特异性上存在缺陷的问题，本发明提供一方面提供了一种抗ca724抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段具有至少一个选自seq id no：1、2、3的重链cdr结构域和/或至少一个选自seqid no：4、5、6的轻链cdr结构域。
7.在一个实施方案中，本发明的抗ca724抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区cdr： seq id no:1所示的cdr1，seq id no:2所示的cdr2，和seq id no:3 所示的cdr3；所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr： seq id no:4所示的cdr1'，seq id no:5所示的cdr2'，和seq id no: 6所示的cdr3'。
8.在一个实施方案中，本发明所述的抗ca724抗体或其抗原结合片段，其特征在于，
所述抗体的重链包含4个fr区，其中至少一个fr 区的氨基酸序列具有如seq id no：7、8、9或10所示的氨基酸序列或者与seq id no：7、8、9或10具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同源性的序列；所述抗体的轻链包含4个fr区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seq id no：11、12、13或 14所示的氨基酸序列或者与seq id no：11、12、13或14具有至少 80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同源性的序列。
9.在一个实施方案中，本发明的抗ca724抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有如seq id no:15所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区具有如seq id no:16所示的氨基酸序列。
10.在一个实施方案中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；优选的，所述恒定区序列选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、 igd任何其中之一，恒定区的序列；优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；优选的，所述恒定区来源于小鼠。
11.在一个实施方案中，本发明的抗ca724抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链氨基酸序列为seq id no:19。
12.在一个实施方案中，本发明的抗ca724抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链氨基酸序列为seq id no:20。
13.本发明另一方面提供一种分离的核酸，其编码前述任一项的抗 ca724抗体或其抗原结合片段。
14.本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码前述任一项的抗体重链可变区。
15.本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码前述任一项的抗体轻链可变区。
16.本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸具有seq id no: 17所示的核苷酸序列。
17.本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸具有seq id no: 18所示的核苷酸序列。
18.本发明另一方面提供一种载体，其包含本发明所述的核酸，优选地所述载体是表达载体。
19.在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(yac)。
20.本发明另一方面提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的载体或核酸，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的酵母细胞或哺乳动物细胞。
21.本发明另一方面提供制备前述任一项所述的抗ca724抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码前述任一项的抗 ca724抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养前述任一项所述的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗724抗体或其抗原结合片段。
22.本发明另一方面提供经化学标记或生物标记的前述任一项抗体或其抗原结合片段。
23.本发明另一方面提供前述任一项抗体或其抗原结合片段与固体介质或半固体介
质偶联制得的偶联物。
24.本发明另一方面提供前述任一项所述的抗体或其抗原结合片段、经化学标记或生物标记的前述任一项抗体或其抗原结合片段和前述任一项偶联物在制备用于诊断癌症的诊断剂或检测ca724的产品中的应用。
25.本发明另一方面提供一种用于检测ca724蛋白的试剂盒，其特征在于包含前述任一项所述的抗ca724抗体或其抗原结合片段或前述任一项所述的偶联物。
26.本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的抗ca724抗体，所述抗体能够很好地识别ca724，并具有高亲和力和特异性。所述抗体具有良好的稳定性和批间差，能够用于制备诊断癌症的诊断剂或检测 ca724的产品，为ca724检测提供了一种新的选择。
附图说明
27.下面结合附图和实施例对本技术的技术方案进一步说明。
28.图1是本发明一个实施例中抗ca724抗体的电泳图。
具体实施方式
29.本发明可通过后续对于本发明一些实施方案的描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。
30.在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制。
31.名词定义
[0032]“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
[0033]
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“vh”。轻链的可变结构域可以被称为“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(vl或vh)由被三个称为“互补决定区”或“cdr”的高变区打断的构架区构成。构架区和cdr的范围已被精确定义，例如在kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(sequences of proteins of immunological interest)，e.kabat等，美国卫生与人类服务(u.s.department of health and human services)， (1983))和chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐cdr的作用，所述cdr主要负责与抗原的结合。
[0034][0035]
当在本文中使用时，“构架”或“fr”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为cdr的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被cdr分隔开的毗邻区域(fr1、fr2、fr3 和fr4)。
[0036]
通常情况下，重链和轻链的可变区vl/vh可由以下编号的cdr 与fr按如下组合排列连接获得：fr1
‑
cdr1
‑
fr2
‑
cdr2
‑
fr3
‑
cdr3
‑
fr4
[0037]
当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。
[0038]
本发明的实例性实施方案
[0039]
本发明一方面提供了一种抗ca724抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有至少一个选自seq id no：1、2、3或与 seq id no：1、2、3具有80％序列同源性的重链cdr结构域和/或至少一个选自seq id no：4、5、6或与seq id no：4、5、6具有80％序列同源性的轻链cdr结构域，其中，seq id no：1
‑
6序列如下所示：
[0040]
seq id no：1：gytftdh(cdr
‑
h1)
[0041]
seq id no：2：spgndd(cdr
‑
h2)
[0042]
seq id no：3：syygh(cdr
‑
h3)
[0043]
seq id no：4：raseniysnla(cdr
‑
l1)
[0044]
seq id no：5：aatnlad(cdr
‑
l2)
[0045]
seq id no：6：qhfwgtpyt(cdr
‑
l3)
[0046]
在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：seq id no:1所示的cdr1，seq id no:2所示的cdr2，和 seq id no:3所示的cdr3；所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：seq id no:4所示的cdr1'，seq id no:5所示的cdr2'，和seq id no:6所示的cdr3'。
[0047]
在一些实施方案中，所述抗体的重链包含4个fr区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seq id no：7、8、9或10所示的氨基酸序列或者与seq id no：7、8、9或10具有至少80％、85％、90％、 95％、98％或99％的序列同源性的序列；所述抗体的轻链包含4个fr 区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seq id no：11、12、13 或14所示的氨基酸序列或者与seq id no：11、12、13或14具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同源性的序列，其中seq id no：7
‑
14序列如下所示：
[0048]
seq id no：7：qvqlqqsdaelvkpgasvkisckas(hfr1)
[0049]
seq id no：8：aihwakqkpeqglewigyi(hfr2)
[0050]
seq id no：9：ikynekfkgkatltadkssstaymqlnsltsedsavyfckr (hfr3)
[0051]
seq id no：10：wgqgttltvss(hfr4)
[0052]
seq id no：11：diqmtqspaslsvsvgetvtitc(lfr1)
[0053]
seq id no：12：wyqqkqgkspqllvy(lfr2)
[0054]
seq id no：13：gvpsrfsgsgsgtqyslkinslqsedfgsyyc(lfr3)
[0055]
seq id no：14：fgggtrleik(lfr4)
[0056]
在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区具有如seq id no:15 所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链可变区具有如seq id no:16所示的氨基酸序列，所述seq id no：15、16序列如下所示：
[0057]
seq id no：15：
[0058]
qvqlqqsdaelvkpgasvkisckasgytftdhaihwakqkpeqglewigyi spgnddikynekfkgkatltadkssstaymqlnsltsedsavyfckrsyyghwgq gttltvss
[0059]
seq id no：16：
[0060]
diqmtqspaslsvsvgetvtitcraseniysnlawyqqkqgkspqllvyaat nladgvpsrfsgsgsgtqyslkinslqsedfgsyycqhfwgtpytfgggtrleik
[0061]
本发明抗体还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述cdr 区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个 (通常为1
‑
50个，较佳地1
‑
30个，更佳地1
‑
20个，最佳地1
‑
10个) 氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内) 氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
[0062]
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0063]
本发明另一方面提供一种分离的核酸，其编码本发明所述的抗 ca724抗体或其抗原结合片段。
[0064]
本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码本发明所述的抗体重链可变区。
[0065]
本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码本发明所述的抗体轻链可变区。
[0066]
本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸具有seq id no: 17所示的核苷酸序列。seq id no：17序列如下所示：
[0067]
seq id no：17：
[0068]
caggtacagctccagcagagtgatgctgaactcgtaaagccgggtgcatccgtgaaaatcagtt gcaaagccagtggctatacgtttacggaccacgcgatacattgggcaaaacagaaacccgagcaggg attggagtggatagggtatatctcacctgggaacgatgatatcaagtacaacgaaaaatttaagggtaa agcgacactcaccgcagacaagagcagttccacagcttatatgcagctcaattcacttaccagcgagga ttctgctgtctacttctgcaagcggagttattacggacattggggccaaggcaccactctcacagtctcct ca
[0069]
本发明另一方面提供一种分离的核酸，所述核酸具有seq id no: 18所示的核苷酸序列。seq id no：18序列如下所示：
[0070]
seq id no：18：
[0071]
gacatacaaatgactcaaagcccagctagtctttccgtatcagtcggtgaaacggtgactattac ttgtcgcgcttctgagaatatctacagcaatctcgcgtggtatcagcagaagcaaggtaaaagcccgca actcctggtatacgcagcaactaacttggctgatggcgtgccgagcaggttctccggcagtggaagtgg tactcaatacagct
tgaaaataaattcactgcaaagtgaggacttcggttcatactactgtcaacattttt ggggaaccccttatacattcggaggaggcaccaagcttgagatcaaa
[0072]
本发明另一方面提供一种宿主细胞，其包含前述任一项所述的载体或核酸，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的酵母细胞、哺乳动物细胞。
[0073]
在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见gerngross，nat.biotech.22：1409
‑
1414(2004)，和li等， nat.biotech.24：210
‑
215(2006)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用sv40转化的猴肾cv1 系(cos
‑
7)；人胚肾系(293hek或293细胞，如例如graham等， j.gen virol.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(c h o)细胞，包括dhfr
‑
cho细胞(urlaub 等，proc.natl.acad.sci.usa77：216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如y0， ns0和sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如yazaki和wu，methods in molecular biology，卷248(b.k.c.lo， ed.，humana press，totowa，nj)，第255
‑
268页(2003)。
[0074]
本发明另一方面提供制备前述任一项所述的抗ca724抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码前述任一项的抗 ca724抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养前述任一项所述的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗724抗体或其抗原结合片段。
[0075]
本发明另一方面提供经化学标记或生物标记的前述任一项抗体或其抗原结合片段。
[0076]
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(koppe等，2005，癌转移评论(cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(chaudhary等，1989，自然(nature)339，394；epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗 (cancer immunology and immunotherapy)51，565)；3.细胞因子如 il
‑
2等(gillies等，1992，美国国家科学院院刊(pnas)89，1428；card 等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(cancer immunology andimmunotherapy)53，345；halin等，2003，癌症研究(cancer research)63， 3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(lapotko等，2005，癌症通信(cancer letters)239，36；huang等，2006，美国化学学会杂志 (journal of the american chemical society)128，2115)；5.病毒颗粒(peng等，2004，基因治疗(gene therapy)11，1234)；6.脂质体 (mamot等，2005，癌症研究(cancer research)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，dt
‑
心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶
‑
样蛋白质(bphl))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0077][0078]
本发明另一方面提供前述任一项抗体或其抗原结合片段与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。
[0079]
本发明另一方面提供前述任一项所述的抗体或其抗原结合片段、经化学标记或生物标记的前述任一项抗体或其抗原结合片段和前述任一项偶联物在制备用于诊断癌症的诊断剂或检测ca724的产品中的应用。
[0080]
本发明另一方面提供一种试剂盒，其特征在于包含前述任一项所述的抗ca724抗体或其抗原结合片段或前述任一项所述的偶联物。
[0081]
在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
[0082]
本发明进一步设计用于检测ca724蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括识别ca724蛋白的抗体，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
[0083]
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0084]
实验材料：
[0085]
pcdna3.4载体，expi293tm表达系统包括expi293细胞、转染试剂、培养基等均购自thermofisher；protein a亲和柱购自ge，其它试剂均为分析纯。
[0086]
实施例一抗ca724抗体的制备
[0087]
1.表达载体构建
[0088]
用ca724抗原与等量免疫佐剂混合，皮下注射免疫balb/c小鼠。小鼠初次免疫后，每两周进行一次加强免疫，共免疫6次。在最后一次免疫3天后取小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤sp2/0使用聚乙二醇法进行融合，在hat选择培养基中培养，筛选出抗ca724的阳性克隆。将筛选得到的抗ca724阳性杂交瘤细胞扩大培养，分离纯化抗ca724 单克隆抗体，并采用lcms/ms技术对抗体进行氨基酸测序，获得抗体可变区序列并推算出基因序列。
[0089]
通过标准基因克隆技术将抗ca724抗体重链可变区基因与轻链可变区基因分别克隆至pcdna3.4载体，构建重链、轻链表达载体。其中，重链质粒包含重链可变区、小鼠igg2αfc区；轻链质粒含轻链可变区、iggκfc区。
[0090]
所对应的抗体重链氨基酸序列为seq id no:19
[0091]
qvqlqqsdaelvkpgasvkisckasgytftdhaihwakqkpeqglewigyi spgnddikynekfkgkatltadkssstaymqlnsltsedsavyfckrsyyghwgq gttltvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslss gvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgc kpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvev htaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktk grpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenyknt qpimdtdgsyfvysklnvqksnwe agntftcsvlheglhnhhtekslshspg
[0092]
所对应的抗体轻链氨基酸序列为：seq id no:20
[0093]
diqmtqspaslsvsvgetvtitcraseniysnlawyqqkqgkspqllvyaat nladgvpsrfsgsgsgtqyslkinslqsedfgsyycqhfwgtpytfgggtrleikg adaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypk
dinvkwkidgserqngvlnsw tdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec。
[0094]
2.转染与瞬时表达
[0095]
采用expi293f表达系统，将重链载体与轻链载体共转染至 expi293f细胞中，进行表达。用expi293培养基培养与扩增细胞，在转染前一天，将expi293f细胞以2.5
×
106ml密度接种于125ml摇瓶中，培养液体积30ml，125
±
5rpm，37℃，8％co2培养过夜。第二天待细胞达到4.5
–
5.5
×
106活细胞/ml，细胞存活率达95～99％方可进行转染。用新鲜培养基调整细胞浓度为23
×
106ml待用。用转染试剂稀释质粒dna，然后将质粒dna缓慢加入到摇瓶中，至重链载体与轻链载体终浓度各为0.5ug/ml。125
±
5rpm，37℃，8％co2进行培养。转染后第五天收集培养液，3000g离心20min后，取上清0.45μm过滤后，过protein a亲和柱进行抗体分离纯化。将过滤后的培养上清缓慢流过protein a柱，上样后用20mm，ph7.0的磷酸钠缓冲液清洗柱子，洗去不与protein a特异性结合的组分，用0.1m，ph2.7甘氨酸
‑
盐酸缓冲液洗脱吸附的抗体，再用ph9.0，1m tris
‑
hcl缓冲液调整抗体组分至中性。将收集的抗体用8％sds
‑
page分析，结果如图1所示。
[0096]
实施例二抗ca724单克隆/重组抗体生物素或吖啶酯标记
[0097]
将实施例一分离纯化得到的单克隆/重组表达的抗ca724抗体浓度调整为2mg/ml，以抗体：生物素＝1：30摩尔比加入生物素进行生物素标记，室温振荡反应30min，超滤3次，除去游离生物素。
[0098]
将实施例一分离纯化得到的单克隆/重组表达的抗ca724抗体浓度调整为2mg/ml，以抗体：吖啶酯＝1：15摩尔比加入进行吖啶酯进行标记，室温振荡反应30min，超滤3次，除去游离吖啶酯。
[0099]
实施例三抗ca724重组抗体反应性
[0100]
将实施例二制备的生物素或吖啶酯标记的抗ca724重组抗体与抗ca724单克隆抗体(吖啶酯或生物素标记)搭配，检测不同浓度 ca724(s0～s5)。在一次性反应杯中分别加入20μl样本、生物素和吖碇酯标记抗体溶液各100μl，37℃孵育10min；加入20μl链霉亲和素磁颗粒，37℃孵育10min；pbs洗涤，依次加入激发液1 (0.1mol/ll hno3溶解1％过氧化氢)和激发液2(0.1mol/l naoh)，测定相对发光强度。
[0101]
结果如表1所示，随ca724浓度升高，发光信号值升高，重组表达的抗ca724抗体可以识别ca724，且反应性接近单克隆抗体。
[0102]
表1
[0103]
[0104]
实施例四抗ca724重组抗体亲和性
[0105]
选用amq生物传感器用于捕获实施例一制备的重组抗体或单克隆抗体抗体，然后分别与抗原进行结合或解离。
[0106]
实验分析如下表：
[0107]
缓冲液20mm hepes，150mm nacl，0.02％tween 20，ph7.4测试浓度抗原稀释10倍，抗体稀释至10μg/ml传感器再生条件ph 1.5glycine
[0108]
动力学分析方法如下表：
[0109]
baseline 160sloading100
‑
180sbaseline 2120sassociation300sdissociation200sregeneration30s
[0110]
实验结果如下表，实施例一制备的重组抗体与单克隆抗体kd值接近，两个抗体的亲和力相近。
[0111]
abkd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)重组抗体1.80e
‑
086.07e+041.09e
‑
03单克隆抗体1.64e
‑
085.47e+048.97e
‑
04
[0112]
实施例五抗ca724重组抗体批间差
[0113]
按照实施例一的方案制备三批抗ca724重组抗体，按实施例二的方案标记吖啶酯，与实施例二制备的生物素标记的抗ca724单克隆抗体搭配组成试剂，检测不同浓度ca724(s0～s5)，比对三组试剂间的反应性，结果如下表所示，不同批原料标记后反应性基本一致。
[0114][0115]
以上述依据本技术的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。