一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及菌株筛选技术领域，更具体地说是涉及一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株及其应用。


背景技术：

2.烟草靶斑病是由瓜亡革菌引起的一种真菌性病害。烟草靶斑病从苗期至烟叶成熟时均可发生，既侵染叶片，也危害茎部。侵染叶片初为圆形水渍状斑点，如温度较高、湿度大、叶片湿润时间较长，则病斑迅速扩展，形成直径2
‑
20cm的不规则斑，有同心轮纹，形成褪绿晕圈枯斑，病斑坏死部分易碎形成穿孔，形似枪弹射击后留下在靶子上的空洞，故称靶斑病。湿度较大时在叶片下表面的病斑边缘常产生该菌的菌丝体及有性世代的子实层和担孢子。
3.目前，烟草靶斑病的防治措施主要是化学农药防治，但是，使用化学药剂进行防治会有农药残留，严重污染环境且对人畜也有危害，并且长期使用同种化学农药会让植株产生一定的抗药性，防治效果会大大打折扣。而生物防治不会对环境产生污染，也不会危害人畜健康，且能有效防治该病害的传播。
4.因此，如何提供一种可以拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株，并将该菌株应用于防治烟草靶斑病中。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株，所述菌株为铜绿假单胞菌gt
‑
6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年7月30日，保藏编号为cctcc no：m 2021953，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类学命名为pseudomonas aeruginosa gt
‑
6。
8.上述拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株在防治烟草靶斑病中的应用。
附图说明
9.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
10.图1附图为本发明提供的gt
‑
6菌株与立枯丝核菌的对峙培养结果图；
11.图2附图为本发明提供的gt
‑
6菌株对立枯丝核菌菌丝的抑菌效果图；
12.图3附图为本发明提供的gt
‑
6菌株的菌落形态图；
13.图4附图为本发明提供的gt
‑
6菌株的16s rdna pcr产物凝胶电泳图；
14.图5附图为本发明提供的gt
‑
6菌株的同源性比对结果图；
15.图6附图为本发明提供的gt
‑
6菌株的系统发育树结果图。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.实施例中用到的材料、试剂和仪器：
18.烟草根际土壤：从湖南省张家界市、永顺县、龙山县、石门县和慈利县的5个烟区烟草靶斑病发生严重的烟田里采集的烟苗根部的土壤。
19.培养基与药剂
20.lb培养基：利用电子天平称取蛋白胨10g、酵母粉5g和nacl 10g，加入500ml的去离子水，用玻璃棒搅拌使药品全部溶解，再加入去离子水定容至1l，将1l的培养基分装在500ml的锥形瓶中，每瓶加入200ml，再在锥形瓶中加入1.5g的琼脂，经高压蒸汽灭菌锅在121℃下湿热灭菌25min，配置成lb固体培养基，冷却备用；
21.lb液体培养基：配置方法同上，但是不加琼脂，将培养基分装于50ml锥形瓶中，每瓶分装20ml，于高压蒸汽灭菌锅在121℃下湿热灭菌25min。配置成lb液体培养基；
22.药剂：蛋白胨、酵母粉、nacl、琼脂粉、ctab、无水乙醇、苯酚
‑
氯仿
‑
异戊醇(25:24:1)、氯仿、异丙醇、无菌水等；
23.实验仪器
24.2l量筒、玻璃棒、2ml离心管、15ml离心管、移液枪、涂布棒、一次性培养皿、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、摇床等。
25.实施例1菌株筛选
26.1)取样
27.从湖南各烟区烟田烟草靶斑病发生严重的烟田中连根挖取健康的烟苗，将烟苗装入灭过菌的纸袋子中保存，带回实验室后，将烟草根部的土抖落下来，将粗土过筛留下细土。
28.2)土壤悬浮液制备
29.称取土样0.1g于15ml离心管中，加入9.9ml的无菌水，制成10
‑2g/ml的土壤悬浮液，利用1ml的移液枪取浓度为10
‑2g/ml的土壤悬浮液于9ml的无菌水中，制成10ml浓度为10
‑3g/ml的土壤悬浮液，按照此方法继续将土壤悬浮液进行稀释，获得浓度为10
‑6g/ml、10
‑7g/ml和10
‑8g/ml的土壤悬浮液，取这三种浓度的悬浮液各200ul，分别加入到pda培养基和lb培养基上进行涂布分菌，每个浓度的悬浮液涂三个培养皿，将涂布完的pda培养皿放在28℃培养箱中，涂布完的lb培养皿放在37℃的培养箱中，两种不同培养基的培养皿都倒置培养。一段时间后观察在不同稀释浓度下菌株长势，筛选出的细菌挑选出合适的单菌落进行划线纯化，筛选出的真菌是挑取菌丝或者在单菌落边缘打菌饼进行纯化，对分离得到的菌株进行编号，并于4℃保存，用于下一步拮抗实验鉴定。共分离得到33株菌株，其中细菌23株，真菌7株和放线菌3株。
30.3)生防菌的筛选
31.以烟草靶斑病病菌(r.solani)为靶标，将从烟草根际土壤分离出的菌株与rsolani进行对峙培养，具体步骤为：将活化后的烟草靶斑病病菌打菌饼接种在pda培养皿上，位置靠培养皿边缘约1cm，再将筛选出的细菌和真菌接种在rsolani的正对面，距离pda培养皿边缘也是约1cm处。筛选出来的细菌和放线菌接种是利用划线产生的单菌落进行，利用灭菌的牙签将单菌落接种在rsolani对面，筛选出来的真菌是按照打菌饼的方式，在真菌菌落边缘打菌饼，再接种到rsolani对面。将筛选出的微生物按照此类方法全部与r.solani进行对峙培养，每种菌接三个重复，同时接种无菌的pda菌饼及点无菌水作为对照组，将接种完的pda培养皿放在28℃的培养箱中培养，培养一段时间后进行观察。筛选出对烟草靶斑病病菌菌丝的生长有明显的抑制效果的生防细菌，编号分别为gt
‑
6，结果见图1；
32.4)生防菌抑菌率的测定
33.将筛选得到的具有抑菌效果的分离物挑选出来，将rsolani菌接种在pda培养皿正中央，将具有抑菌效果的微生物接种在rsolani菌饼四周，真菌分离物打菌饼接种，接种四个点，做三个重复，对照组设置为接种无菌pda菌饼和点无菌水，放在28℃培养箱中培养，当对照组的rsolani菌丝长满培养皿时，测量接种拮抗菌后rsolani的直径，根据处理组和对照组直径(cm)的大小来计算拮抗菌的抑菌率。抑菌率(100％)＝(对照组菌落直径
‑
处理组菌落直径)/对照菌落直径
×
100％。
34.在对照组的立枯丝核菌长满直径为90mm的培养皿后，利用游标卡尺测量接种生防菌后立枯丝核菌菌落直径，设置的三个重复，计算生防菌处理后的菌落平均直径(mm)，计算出菌株gt
‑
6的抑菌率为63.98％，见图2和表1；
35.表1
[0036][0037]
5)生防菌菌株的鉴定
[0038]
形态观察
[0039]
菌株gt
‑
6菌落圆形，边缘平整，菌落，颜色为灰绿色，有金属光泽，见图3；
[0040]
(1)生防菌dna的提取
[0041]
将筛选出的具有拮抗效果的菌株进行分子鉴定，采用改良的ctab法提取菌株的dna。
[0042]
将纯化好的真菌接种在垫有玻璃纸的pda培养皿中，接种各菌株于玻璃纸上，与28℃培养至菌丝长满培养皿，挂下菌丝于2ml离心管中备用；
[0043]
1)在装有真菌的菌丝的2ml离心管中加入500μl ctab，60℃水浴45min，每隔15min摇晃一次；
[0044]
2)水浴完成后在离心管中加入500μl的苯酚
‑
氯仿
‑
异戊醇(25:24:1)，后静置5min，再12000rpm离心10min；
[0045]
3)在离心期间按比例配置氯仿
‑
异丙醇(24:1)，将无水乙醇配置成75％的乙醇
[0046]
4)离心完成后，取上清液于新的离心管中，按照1:1的比例加入氯仿
‑
异戊醇(24:
1)，静置5min，再在12000rpm离心10min；
[0047]
5)取上清液加入到新的2ml离心管内，加入两倍体积的无水乙醇，然后在
‑
20℃冰箱中放置30min；
[0048]
6)在12000rpm下离心10min，倒掉液体后加入1ml的75％的无水乙醇，8000rpm下离心5min，弃上清液，将离心管倒扣在吸水纸上使管内残留液体挥发干净，再加入50μl的超纯水溶解dna，
‑
20℃保存备用。
[0049]
(2)dna的pcr扩增
[0050]
pcr扩增体系及扩增程序同第二章
[0051]
将通过ctab法提取得到的dna为模板，以16s rdna通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
，如seq id no.1所示)和1492r(5
’‑
ctacggctaccttgttacga
‑3’
，如seq id no.2所示)为引物(订购于上海生工生物工程有限公司)。
[0052]
pcr扩增体系如表2；
[0053]
程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，72℃再延伸10min，30个循环，保存于4℃。
[0054]
表2 16s rdna通用扩增体系
[0055][0056]
(3)dna样品测序
[0057]
将扩增成功点样后剩余的pcr产物写好标签后送至进行测序，将测序得到的一段序列复制在ncbi上进行blast比对，比对结果见图5；用ncbi下载假单胞菌属的细菌序列，并以芽孢杆菌属的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)作为外群，利用nj法构建系统发育树，见图6。
[0058]
菌株gt
‑
6大小为1421bp，与登录号为mn736634.1的荧光假单胞菌的序列的同源性高达99％，且根据系统发育树分析可以初步确定从烟草根际土壤中分离得到的生防菌为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)。
[0059]
6)菌株gt
‑
6对烟草靶斑病的田间防治评价
[0060]
在湘西花垣县选取烟草靶斑病重病烟田2亩，试验设4个处理：80％的代森锰锌可湿性粉剂；10％井冈霉素水剂，gt
‑
6发酵液；培养基(对照)。每个处理设置4个重复，共16个小区，每个小区面积约50m2。各处理用药量为：80％的代森锰锌可湿性粉剂稀释1000倍施用；gt
‑
6发酵液按200ml/亩，兑水50kg进行施用；10％井冈霉素水剂稀释600倍施用。在初见零星病斑时开始用药，每隔5
‑
7天连续用药3次。用药方法：喷雾施用，叶片正反两面喷施。
[0061]
每次施药前及最后一次施药后10天进行调查，每个小区调查15株烟株上的全部叶片，据《烟草病虫害分级及调查方法》(gbt 23222
‑
2008)，以叶为单位分9级调查。统计各处理的发病率、病情指数、相对防效，病情指数＝100
×
∑(各级病叶数
×
各级代表值)/(调查总叶数
×
最高级代表值)、相对防治效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数
×
100。
[0062]
田间小区试验调查结果表明，随着施药时间的延长，对照组(ck)、80％的代森锰锌可湿性粉剂、10％井冈霉素水剂、gt
‑
6发酵液处理组发病率和病情指数逐渐增加，最后一次调查时达到最高,发病率分别为61.32％、36.67％、27.08％和16.58％，gt
‑
6发酵液处理组发病率和病情指数明显较低，对烟草靶斑病的防效最高可达71.26％。
[0063]
表gt
‑
6对烟草靶斑病的防治效果
[0064][0065]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。