一种检测氨基甲酸乙酯的方法

1.本发明涉及食品安全技术领域，具体地，涉及一种检测氨基甲酸乙酯的方法。


背景技术：

2.氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，ec)又名尿烷，在发酵食品食品领域中生产和储存过程中不可避免产生的副产物。大量研究表明氨基甲酸乙酯可以诱导肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病的发生。ec的污染已成为近年来食品安全热点问题之一。2007年，世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)将ec列为2a类致癌物。因此，对发酵食品中的ec分析检测具有重大意义。
3.目前，ec检测方法有气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、液相色谱-荧光法和高效液相色谱-荧光法等，这些方法虽广泛应用,灵敏度高,但是对样品的前处理具有较高要求，且设备昂贵，无法实现现场快速检验,因此近年来快速，便捷的基于抗原抗体特异性识别原理的酶联免疫吸附法得到迅猛发展。ec由于不含有能够诱导免疫反应的结构,且具有超低的分子量(89.09da)，至今对其进行高灵敏直接免疫检测未能突破。目前仅能基于检测其衍生物的方式进行免疫分析检测。方法建立过程中，必要的检测全抗原的合成一直存在反应步骤繁琐，合成原料昂贵，制备过程威胁操作人员身体健康的限制因素。中国专利cn201410533042.1公开了一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法；中国专利cn201410365882.1公开了可见分光光度法测定氨基甲酸乙酯含量的方法；中国专利cn201410365881.7公开了薄层色谱法半定量测定氨基甲酸乙酯的方法。
4.利用噬菌体展示肽库淘筛得到的模拟表位肽可成功代替免疫分析方法中的完全抗原，建立的异源免疫分析方法比传统的化学抗原免疫分析方法显著提升。该方法筛选方便省时省力，成本低廉，性质稳定，最重要可降低实验人员的暴露有毒环境的风险。模拟表位肽代替抗原在免疫系统分析检测领域具有广阔的应用前景，但目前国内外应用于ec分析检测的模拟表位蛋白尚未报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测氨基甲酸乙酯的方法，其利用氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽代替抗原建立竞争型噬菌体酶联免疫分析法(phage-elisa)，用于ec的检测。
6.本发明的第一个目的是提供一种氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽。
7.本发明的第二个目的是提供一种编码氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽的基因。
8.本发明的第三个目的是提供一种噬菌体。
9.本发明的第四个目的是提供另一种噬菌体。
10.本发明的第五个目的是提供一种检测氨基甲酸乙酯的方法。
11.本发明的第六个目的是提供一种检测氨基甲酸乙酯的试剂盒。
12.本发明的第七个目的是提供所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述基因、所
述噬菌体、和/或所述另一噬菌体任意一种或几种在检测氨基甲酸乙酯衍和/或氨基甲酸乙酯衍生物中的应用。
13.本发明的第八个目的是提供所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、和/或所述另一噬菌体任意一种或几种在制备检测氨基甲酸乙酯衍和/或氨基甲酸乙酯衍生物的试剂盒中的应用。
14.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
15.(1)将纯化的氨基甲酸乙酯衍生物单克隆抗体包被在高吸附酶标板上，用3％(w/v)脱脂奶粉封闭酶标板，随后将随机七环噬菌体展示库加入酶标板中进行淘筛，按照结合-洗脱-扩增的淘选方案进行，通过3轮的富集淘筛。其中，三轮淘筛包被的抗体用量和用于竞争洗脱噬菌体的ec衍生物用量依次减少；
16.(2)经过3轮淘筛后，随机挑选40个噬菌体单克隆进行噬菌体elisa的初步鉴定，对于得到的7个阳性克隆进行扩增，测序共发现3种序列。
17.本发明利用竞争型模式的淘筛可展示模拟表位肽的噬菌体克隆，展示模拟表位蛋白的噬菌体与待测物(氨基甲酸乙酯的衍生物)，竞争包被在酶标板上的单克隆抗体(该抗体可以特异性识别氨基甲酸乙酯衍生物)。判定阳性噬菌体克隆的依据是，加有噬菌体和pbs的混合物的反应孔有吸光值，即与噬菌体与抗体结合；同时在对照孔中(加入的是噬菌体与pbs稀释的待测物的混合物)吸光值显著降低，即待测物可以把噬菌体从抗体的结合位点上竞争下来，此噬菌体即可展示模拟表位肽的噬菌体克隆。该噬菌体以m13噬菌体质粒为载体，编码外源模拟表位肽的基因插入到噬菌体编码的膜蛋白的gⅲ基因中，使外源蛋白可展示于噬菌体pⅲ壳蛋白的n端。
18.因此本发明要求保护以下内：
19.一种氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽，其氨基酸序列如seq id no：1、3或5所示，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(i)
[0020][0021]
优选地，其氨基酸序列如seq id no：3所示。
[0022]
该结构式如式(i)的氨基甲酸乙酯衍生物即为占吨聚甲酸乙酯。
[0023]
一种编码氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽的基因，其核苷酸序列如seq id no：2、4或6所示，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(i)
[0024][0025]
优选地，其核苷酸序列如seq id no：4所示。
[0026]
一种噬菌体，所示噬菌体表面表达有所述的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽。即氨基酸序列如seq id no：1、3或5所示氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽和展示于噬菌体pⅲ衣壳蛋白，即展示氨基酸序列如seq id no：1、3或5所示氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽的噬菌体。
[0027]
优选地，所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽展示于噬菌体pⅲ壳蛋白的n端。
[0028]
一种噬菌体，所示噬菌体表面表达所述的基因。
[0029]
优选地，所述菌体以m13噬菌体质粒为载体，所述基因插入到噬菌体编码的膜蛋白的gⅲ基因中。
[0030]
一种检测氨基甲酸乙酯的方法，包括以下步骤：
[0031]
s1.待测样本进行衍生化反应，其中的氨基甲酸乙酯的酰胺基团与占吨氢醇的羟基，脱水，生成占吨聚甲酸乙酯；
[0032]
s2.以抗氨基甲酸乙酯衍生物抗体作为包被抗体，以所述的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述噬菌体、所述噬菌体任意一种或几种作为竞争抗原进行酶联免疫检测。
[0033]
优选地，所述衍生化反应为：待测样本与占吨氢醇的混合液体，酸性环境下进行衍生化反应，碱性条件下中止衍生化反应。
[0034]
最优选地，包括以下步骤
[0035]
1、抗体包被
[0036]
用pbs稀释抗氨基甲酸乙酯衍生物(占吨聚甲酸乙酯，结构式如式i所示)的单克隆抗体，包被酶标板，孵育过夜。次日，pbst洗涤，封闭，甩干后。
[0037]
2、衍生
[0038]
待测样品取与占吨氢醇混合，然后加入hcl充分反应，后加入naoh终止衍生反应。反应混合液用pbs稀释，作为后续phage elisa的竞争抗原。
[0039]
3、phage elisa
[0040]
所述噬菌体克隆与上一步的衍生产物一同加入包被抗体的微孔中，孵育，pbst清洗后加入hrp标记的抗m13噬菌体hrp二抗，再次用pbst清洗，加入tmb显色液，避光显色，50μl 10％(v/v)h2so4终止，读取450nm吸光度。
[0041]
4、结果判读
[0042]
以各浓度氨基甲酸乙酯标准品的对数值为横坐标，所对应的b/b0为纵坐标(b0位氨基甲酸乙酯浓度为0的孔测的吸收值，b其他系列氨基甲酸乙酯浓度孔的吸光值。
[0043]
一种检测氨基甲酸乙酯的试剂盒，含有所述的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述噬菌体、和/或所述噬菌体任意一种或几种。
[0044]
优选地，还含有抗氨基甲酸乙酯衍生物抗体。
[0045]
更优选地，还含有占吨氢醇。
[0046]
最优选地，含有抗氨基甲酸乙酯衍生物(占吨聚甲酸乙酯，结构式如式i所示)的单克隆抗体、所述噬菌体、占吨氢醇、hcl(0.5mol/l)、naoh(1.5mol/l)、pbs、pbst、hrp标记的抗m13噬菌体hrp二抗、tmb显色液、10％(v/v)h2so4。
[0047]
所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、和/或所述另一噬菌体任意一种或几种在检测氨基甲酸乙酯和/或氨基甲酸乙酯衍生物中的应用，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(i)
[0048][0049]
所述氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽、所述基因、所述噬菌体、所述另一噬菌体任意一种或几种在制备检测氨基甲酸乙酯衍和/或氨基甲酸乙酯衍生物的试剂盒中的应用，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(i)
[0050][0051]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0052]
(1)新颖：本发明获取的氨基甲酸乙酯衍生物模拟表位肽是国内外首次报道的与ec衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽；
[0053]
(2)实用：利用本发明中所述的展示模拟表位肽的噬菌体可以建立灵敏，快速的竞争型酶联免疫分析法。
[0054]
(3)高灵敏度，利用本发明提供的展示模拟表位肽的噬菌体构建的竞争型免疫分析方法，ic50为0.89ng/ml，检测限为0.01ng/ml。与传统的基于半抗原的免疫分析方法灵敏度相比，本方法的灵敏度提高了928倍。
[0055]
(4)高特异性：基于本发明提供的展示模拟表位肽的噬菌体建立的竞争型免疫分析方法对ec的结构类似物的交叉反应良好。
附图说明
[0056]
图1为噬菌体展示模拟表位肽淘筛示意图。
[0057]
图2为噬菌体展示模拟表位肽的phage-elisa筛选结果。
[0058]
图3为基于噬菌体展示模拟表位肽检测氨基甲酸乙酯的标准曲线的建立
具体实施方式
[0059]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0060]
1、主要实验材料：
[0061]
氨基甲酸乙酯衍生物(即占吨聚甲酸乙酯)单克隆抗体由华南农业大学食品学院广东省食品安全重点实验室制备，经过蛋白g柱纯化，氨基甲酸乙酯衍生物结构式如式(i)
[0062][0063]
噬菌体展示七环肽库购于neb公司
[0064]
2、主要试剂：
[0065]
蛋白胨，酵母提取物，琼脂，iptg、xgal、peg8000、辣根过氧化物酶标记的抗m13单克隆抗体(sino biological)
[0066]
3、主要试剂配方：
[0067]
lb液体培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g nacl，加入三级水100ml，高压灭菌，室温储存。
[0068]
top培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g nacl，0.7g琼脂，加入三级水100ml，高压灭菌，室温储存。
[0069]
iptg+xgal：1.25giptg，1gxgal，用25mldmf溶解后过有机膜除菌。
[0070]
lb/iptg/xgal平板:1l lb培养基加入15g/l琼脂后灭菌，冷却至70度以下,加入1ml iptg/xgal混合物混匀后，倒平板。该平板培养基需避光储存于4度条件。
[0071]
tet：20mg/ml，用无水乙醇:水＝1:1溶解
[0072]
20％peg8000/nacl：80g peg8000，58.44gnacl，三级水定容至400ml，高压灭菌，室温储存。
[0073]
tbs：先配tris-hcl(ph＝7.5)：15.764gtris，三级水定容至200ml，用hcl调ph至7.5；取150ml tris-hcl溶解17.532g nacl，再定容至200ml。高压灭菌，室温储存。
[0074]
实施例1与氨基甲酸乙酯衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽的筛选
[0075]
一、实验方法
[0076]
1、噬菌体的筛选和扩增(技术路线如图1所示)
[0077]
(1)淘选：用0.0 1mol/l pbs稀释抗体纯化后的抗氨基甲酸乙酯衍生物抗体，取100μl，10μg/ml于高吸附酶标板中(3个平行)，4℃包被过夜。
[0078]
(2)将步骤(1)的酶标板用pbst洗涤两遍(300μl/孔)，3％(w/v)脱脂奶粉，37℃孵育1小时。
[0079]
(3)将步骤(2)的酶标板的封闭液甩干后，向酶标板中每孔加入100μl的10
11
pfu/ml的噬菌体展示七环肽库(5％脱脂奶粉稀释)，4℃孵育2小时。
[0080]
(4)用预冷的pbst洗10次，冷pbs清洗10次后，加入10μg/ml的氨基甲酸乙酯衍生物进行竞争洗脱4℃竞争2h。
[0081]
(5)收集步骤(4)的上清，将竞争后的洗脱液(取少量噬菌体测滴度)加入到装有20ml的大肠杆菌er2738(od
600
为0.01至0.05)的250ml三角瓶中，37℃摇床，250rpm,培养4.5h。
[0082]
(6)将扩增后的噬菌体移入50ml的离心管中，在4℃下12000rpm，离心10min,取上清。
[0083]
(7)向(6)上清中加入体积1/6的20％peg8000/nacl,充分混匀后，4℃冰浴过夜
[0084]
(8)将(7)步骤中的溶液于4℃，12000rpm的条件，再次离心10min，去上清，加入1ml tbs重悬沉淀物，再次相同条件离心一次。
[0085]
(9)取350μl tbs重悬步骤(8)的沉淀物用于下一轮的筛选。
[0086]
(10)步骤(1)到(9)为一轮筛选和扩增，重复(1)到(9)两次作为第二轮和第三轮的筛选和扩增，其中第二轮和第三轮的筛选和扩增中步骤(1)使用的抗体浓度分别为5μg/ml和2.5μg/ml，中第二轮和第三轮的筛选和扩增中步骤(4)使用的氨基甲酸乙酯衍生物为1μg/ml和100ng/ml。
[0087]
2、洗脱液或扩增后的噬菌体滴度的测定
[0088]
(1)取10ml lb液体培养基，加入0.1％的四环素，接种大肠杆菌er2738，37℃转速250rpm，培养至od600为～0.5；
[0089]
(2)lb/iptg/xgal平板至于37℃烘箱预热至少1h，预热top培养基，使其保持温度在45℃左右。
[0090]
(3)对洗脱液或扩增后的噬菌体，稀释到相应的倍数，一般洗脱液稀释10～103倍，扩增后的噬菌体稀释108～10
10
倍。
[0091]
(4)取10μl相应稀释倍数的噬菌体加入到200μl准备好的od600为～0.5的大肠杆菌er2738，斡旋混匀。加入到3ml准备好的top培养基中，混匀，平铺到(2)步准备好的平板上，冷却10min,防于37℃培养箱中倒置培养过夜。
[0092]
(5)记录平板上的蓝色噬菌体斑点，用于计算所测的噬菌体的滴度。
[0093]
二、实验结果
[0094]
结果如下表1。
[0095]
表1噬菌体的滴度：
[0096][0097]
结果显示，从淘筛从第2轮开始富集，第3轮output最高，根据噬菌体展示库说明书建议，淘筛只可进行3轮，根据此结果从第3轮output的滴度测定平板上挑取若干克隆进行阳性克隆的筛选。
[0098]
实施例2可与氨基甲酸乙酯衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽的鉴定
[0099]
一、实验方法
[0100]
(1)实施例1第三轮淘筛后，对洗脱液进行滴度测定，选择少于100个蓝色噬菌体的培养基板，从中随机挑取40个蓝色噬菌斑，进行扩增和鉴定。
[0101]
(2)蓝色噬菌斑扩增步骤，与洗脱液扩增步骤相似。将单个噬菌斑接种到装有1ml的er2738(od
600
为0.01至0.05)的4ml离心管中，37℃摇床，250rpm，培养4.5h。
[0102]
(3)培养液4℃12000rpm离心10min，上清可用于之后的阳性克隆的应用基于噬菌体酶联免疫分析方法进行鉴定以及序列测定。
[0103]
(a)鉴定的具体方法为：
[0104]
用pbs稀释抗体纯化后的抗氨基甲酸乙酯衍生物抗体，取100μl，10μg/ml于高吸附酶标板中，4℃包被过夜。次日酶标板用pbst洗涤两遍(300μl/孔)，3％(w/v)脱脂奶粉，37℃孵育1小时。取50μl(3)的上清液分别与等体积的1μg/ml氨基甲酸乙酯衍生物或pbs混合加入酶标孔中，同时用1μg/ml bsa作为对照试验检测非特异性结合能力。在室温孵育1h后并用pbst洗涤7次，将100μl抗m13噬菌体抗体-hrp用pbst稀释5000倍(v/v)后加入孔中，在37℃条件下孵育30分钟。再次洗涤5次，每孔加入100μl tmb液体底物缓冲液，37℃孵育10分钟。最后，在用50μl的10％(v/v)h2so4终止反应后读取吸光度(450nm)。
[0105]
选择阳性克隆的标准为：具有可结合抗体(吸光值高于1.5)，同时可以被氨基甲酸乙酯衍生物竞争(吸光值低于0.5)，并对bsa的结合能力较弱(吸光值低于0.2)。
[0106]
(b)序列测定
[0107]
鉴定得到的阳性克隆，通过测序引物96giii进行测序，获取基因序列,测序引物96giii的序列为：ttttgaaatctagcaatgcgattgatactcccg。
[0108]
二、实验结果
[0109]
如图2所示，挑选的40个克隆中有7株阳性克隆，进行了后续测序。经测序鉴定后，发现了3种不同的模拟表位肽序列。
[0110]
测序结果如表2所示
[0111]
表2：
[0112][0113]
实施例3可与氨基甲酸乙酯衍生物抗体特异性结合的模拟表位肽作为竞争抗原在酶联免疫分析方法中的应用
[0114]
一、实验方法
[0115]
1、抗体包被
[0116]
用pbs稀释抗氨基甲酸乙酯衍生物(占吨聚甲酸乙酯，结构式如式i所示)的单克隆抗体(可以特异性识别结结构式如式(i)所示的氨基甲酸乙酯衍生物)，2μg/ml包被酶标板，在4℃条件下孵育过夜。次日，应用pbst洗涤2次，3％(w/v)脱脂奶粉37℃封闭1h。甩干后，可存放于4℃用于后续实验。
[0117]
2、标准曲线的建立
[0118]
实施例2淘筛到的3株噬菌体虽均可模拟氨基甲酸乙酯的衍生物的模拟抗原表位肽与其单克隆抗体的结合，且灵敏度无显著区别(对1ng/ml的氨基甲酸乙酯的衍生物的抑制率为50％
±
1％)，但根据与氨基甲酸乙酯单克隆抗体结合，吸光值取1～1.2时，噬菌体的滴度测定结果显示，其亲和力存在一定的差异，其中n.10(seq id no:3)亲和力最强10
11
pfu/ml，n.27最弱(10
13
pfu/ml)，n.1滴度为10
12
pfu/ml。综上，基于亲和力最高的噬菌体(n.10)构建标准曲线。
[0119]
衍生：氨基甲酸乙酯的酰胺基团与占吨氢醇的羟基，在酸性条件下脱水，生成占吨聚甲酸乙酯。即，用pbs配置系列浓度的氨基甲酸乙酯标准品：每个浓度的标准品取0.6ml与0.4ml占吨氢醇(4mg/ml)，然后加入0.1ml hcl(0.5mol/l)反应30min后加入0.1mlnaoh(1.5mol/l)终止衍生反应，即生成氨基甲酸乙酯(ec)的衍生物占吨聚甲酸乙酯(xec)。反应混合液用pbs稀释5倍，取50μl作为后续phage elisa的竞争抗原。
[0120]
phage elisa：50μl的n.10噬菌体克隆与50μl pbs或者上述系列浓度氨基甲酸乙酯的衍生产物一同加入包被抗体的微孔中，37℃孵育45min，pbst清洗7次后加入100μl的5000倍(v/v)稀释hrp标记的抗m13噬菌体hrp二抗，再次用pbst清洗5次，加入100μl tmb显色液，避光显色10min,50μl 10％(v/v)h2so4。以各氨基甲酸乙酯标准品浓度的对数值为横坐标，所对应的b/b0为纵坐标(b0位氨基甲酸乙酯浓度为0的孔测的吸收值，b其他系列氨基甲酸乙酯浓度孔的吸光值。
[0121]
二、实验结果
[0122]
标准曲线如图3，该方法的检测氨基甲酸乙酯的lod(ic
10
)为0.01ng/ml，定量范围为0.06～12.14ng/ml(y＝-0.30897lgx+0.5277)。
[0123]
实施例4可与氨基甲酸乙酯衍生物抗体特异性结合的抗原表位肽特异性评估
[0124]
一、实验方法
[0125]
以氨基甲酸乙酯衍生物交叉反应率(cr)为100％，测定了3种结构相似的化合物：氨基甲酸甲酯和丙烯酰胺的衍生物以及衍生剂占吨醇的交叉反应率(cr)。
[0126]
检测方法为：
[0127]
(1)衍生：同实施例3。
[0128]
(2)50μl的n.10噬菌体克隆与50μl待测化合物的衍生产物一同加入包被抗体的微孔中，37℃孵育45min，pbst清洗7次后加入100μl的5000倍(v/v)稀释hrp标记的抗m13噬菌体hrp二抗，再次用pbst清洗5次，加入100μl tmb显色液，避光显色10min,50μl 10％h2so4。读取吸光度(450nm)。
[0129]
二、实验结果
[0130]
结果如表3所示，丙烯酰胺的衍生物以及衍生剂占吨醇的交叉反应率均小于0.1％，对氨基甲酸甲酯的衍生物有3.6％，但由于在含有氨基甲酸乙酯的样品中，不含氨基甲酸甲酯，所以即使有交叉对后续实际样品的检测不会造成干扰。表明淘筛到的与氨基甲
酸乙酯衍生物抗体特异性结合的抗原表位肽具有良好的特异性，有望能实现无干扰地对氨基甲酸乙酯的快速检测。
[0131]
表3噬菌体展示模拟表位肽与氨基甲酸乙酯结构类似物的交叉反应：
[0132][0133][0134]
实施例5一种检测氨基甲酸乙酯的方法
[0135]
1、抗体包被
[0136]
用pbs稀释抗氨基甲酸乙酯衍生物(占吨聚甲酸乙酯，结构式如式i所示)的单克隆抗体，2μg/ml包被酶标板，在4℃条件下孵育过夜。次日，应用pbst洗涤2次，3％(w/v)脱脂奶粉37℃封闭1h。甩干后，可存放于4℃用于后续实验。
[0137]
2、衍生
[0138]
待测样品取0.6ml与0.4ml占吨氢醇(4mg/ml)，然后加入0.1ml hcl(0.5mol/l)反应30min后加入0.1ml naoh(1.5mol/l)终止衍生反应。反应混合液用pbs稀释5倍，取50μl作为后续phage elisa的竞争抗原。
[0139]
3、phage elisa
[0140]
50μl的实施例2淘选得到的n.10噬菌体克隆与50μl上一步的衍生产物一同加入包被抗体的微孔中，37℃孵育45min，pbst清洗7次后加入100μl的5000倍(v/v)稀释hrp标记的抗m13噬菌体hrp二抗，再次用pbst清洗5次，加入100μl tmb显色液，避光显色10min，50μl 10％(v/v)h2so4。读取450nm吸光度。
[0141]
4、结果判读
[0142]
以各浓度氨基甲酸乙酯标准品的对数值为横坐标，所对应的b/b0为纵坐标(b0位氨基甲酸乙酯浓度为0的孔测的吸收值，b其他系列氨基甲酸乙酯浓度孔的吸光值。
[0143]
实施例6一种检测氨基甲酸乙酯的试剂盒
[0144]
1、组成
[0145]
抗氨基甲酸乙酯衍生物(占吨聚甲酸乙酯，结构式如式i所示)的单克隆抗体、实施例2淘选得到的n.10噬菌体克隆、占吨氢醇、hcl(0.5mol/l)、naoh(1.5mol/l)、pbs、pbst、hrp标记的抗m13噬菌体hrp二抗、tmb显色液、10％(v/v)h2so4。
[0146]
2、使用方法
[0147]
同实施例6。
[0148]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。