一种同时定量检测血浆中Cys、Hcy和GSH的新型荧光探针及其制备方法和用途

一种同时定量检测血浆中cys、hcy和gsh的新型荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种用于同时定量检测区分血浆中cys、hcy和gsh的新型荧光探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy)和谷胱甘肽(gsh)是目前人体中已知含量最丰富的小分子生物硫醇，在许多人体代谢和稳态中起着关键作用。尽管cys、hcy和gsh的结构和活性非常相似，但它们具有不同的生理和病理作用。其中，cys参与酶催化、解毒、蛋白质合成和代谢。cys异常水平可引起多种疾病，如生长迟缓、皮肤损伤、水肿、嗜睡和肝脏损害；血浆中hcy水平升高被认为是心血管疾病、血栓形成、阿尔茨海默病、肾功能障碍和骨质疏松等高危因素。谷胱甘肽能够维持生物系统中的氧化还原稳态。谷胱甘肽水平失衡与肝损伤、艾滋病、癌症、衰老等疾病有关。血浆等生物液体是跟踪人体生物硫醇水平的最佳非侵入性基质。因此，定量检测生物液体中cys、hcy和gsh水平，为筛选和诊断与生物硫醇相关的疾病以及解剖其生理和病理过程提供了一种快速的方法。
3.目前，已有多种检测生物硫醇的分析技术被报道，与高效液相色谱(hplc)、质谱法、毛细管电泳法和电化学等传统方法相比，荧光探针具有高选择性和高灵敏度，在生物硫醇的体外和/或体内定性和定量检测方面具有优势。到目前为止，生物硫醇荧光探针的构建已经取得了很大的进展。这些探针能够区分生物硫醇和其他氨基酸。然而，由于三种生物硫醇的结构和活性非常相似，大多数报道的荧光探针无法区分cys、hcy和gsh，这阻碍了对它们在生理和病理事件中的作用的进一步研究。到目前为止，已经开发出了少量特异性检测cys、gsh和cys/hcy的荧光探针。此外，在不同荧光通道中能同时识别cys和gsh以及cys/hcy和gsh的荧光探针报道甚少。然而，开发能够同时识别三种生物硫醇的荧光探针仍然是一个巨大的挑战。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的上述不足之处，本发明提供了一种同时定量检测血浆中生物硫醇的新型荧光探针及其制备方法与应用。所述探针能够在不同ph条件下同时识别不同荧光通道中的cys、hcy和gsh，并且已经成功地应用于同时定量检测血浆样品中cys、hcy和gsh含量，它不仅选择性好，灵敏度高，而且制备方法简单。本发明是通过如下技术方案实现的：
5.一种同时定量检测血浆中cys、hcy和gsh的荧光探针，其结构如下：
6.7.同时定量检测血浆中cys、hcy和gsh的荧光探针的制备方法，按照下述步骤进行：
8.步骤1、称取4
‑
(二乙氨基)水杨醛溶于正丁醇中，接着加入硝基乙酸乙酯和乙酸，搅拌均匀，再加入哌啶，然后将混合液加热回流搅拌反应；反应结束后，将沉淀物抽滤得到滤饼，沉淀物经正丁醇和石油醚重结晶进一步提纯，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基；
9.步骤2、将氯化亚锡加到冰浴环境的浓盐酸中，随后加入步骤1制备的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基，常温搅拌，反应一段时间后，在冰浴下加入氢氧化钠使得溶液呈中性，用蒸馏水和乙酸乙酯对混合液进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去多余的溶剂，之后用乙醇重结晶，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基；
10.步骤3、将步骤2得到的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基溶于盐酸，将混合液加热回流搅拌反应；反应结束后，加入氨水中使溶液呈中性，用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，回收有机层，减压蒸馏除去多余的溶剂，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基。
11.步骤4、将步骤3得到的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基和4
‑
氯
‑7‑
硝基苯并
‑2‑
氧杂
‑
1,3
‑
二唑加入到乙腈溶液中，接着加入碳酸钾，室温下搅拌反应，反应结束后，除去多余的溶剂，将残余物通过柱层析色谱法进行纯化，即可得到定量区分检测cys、hcy和gsh的新型荧光探针。
12.步骤1中，所述4
‑
(二乙氨基)水杨醛、正丁醇、硝基乙酸乙酯、哌啶、乙酸的用量比为1g～2g：10ml～20ml：0.5ml～1ml：70μl～80μl：0.2ml～0.3ml。
13.步骤1中，所述加热回流搅拌反应的温度为100～105℃，时间为10～12h。
14.步骤2中，所述氯化亚锡、浓盐酸、7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基的用量比为0.6g～0.7g：2ml～4ml：0.2g～0.3g。
15.步骤2中，所述常温搅拌反应的时间为1～2h，所述重结晶用的温度为90℃。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
16.步骤3中，所述7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基、盐酸的用量比为0.4g～0.5g：5ml～6ml，其中盐酸的浓度为1m。
17.步骤3中，所述加热搅拌反应的温度为110～120℃，反应的温度时间为2～4h。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
18.步骤4中，所述7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基、4
‑
氯
‑7‑
硝基苯并
‑2‑
氧杂
‑
1,3
‑
二唑、碳酸钾、乙腈的用量比为0.3g～0.4g：0.4g～0.5g：0.2g～0.3g：4ml～5ml。
19.步骤4中，所述室温反应的时间为4～5h。所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。
20.将本发明的新型荧光探针用于同时定量区分检测血浆中的cys，hcy和gsh的用途。
21.本发明提供的荧光探针可用于同时定量检测血浆中cys、hcy和gsh的含量，具体方法如下：
22.(1)取健康志愿者静脉血3.0ml。血样置于预冷的乙二胺四乙酸(edta)真空管中，随后立即在4℃下2500r/min离心10min。取上清液作为人血浆进行分析。用dmso制备了探针yf(1
×
10
‑3m)的母液。取数个5ml容量瓶，并且量取25μl荧光探针母液和1ml dmso于每个5ml容量瓶中。然后，在每个容量瓶中分别加入血浆提取液样本上清液100μl和不同体积1
×
10
‑2m的cys溶液(0、2.5、5、7.5、10、15、20μl)。接着将装有混合液的容量瓶分别用20mm的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4或5.6)定容到5ml，摇匀，室温放置10min。最后将混合溶液移入石英比色皿中，备用；
23.(2)将步骤(1)得到的样品，在ph为7.4，激发波长为350nm时，在发射波长为508nm处可检测到cys、hcy和gsh的总浓度；
24.(3)将步骤(1)得到的样品，当ph仍然为7.4，激发波长改为475nm时，在发射波长为550nm处可检测到cys和hcy的总浓度；
25.(4)将步骤(1)得到的样品，当ph值改为5.6，激发波长仍然为475nm，在发射波长为550nm处可检测出cys的浓度。
26.然后通过数学计算出血浆中hcy和gsh的含量。
27.本发明的有益效果如下：
28.(1)本发明提供了一种全新的可用于cys、hcy和gsh定量分析检测的荧光探针，该荧光探针合成方法简单，对cys、hcy和gsh有很好的选择性，lys，arg，ser，leu，phe，ala,gly，glu，val，gln，k
+
，na
+
，mg
2+
，zn
2+
，h2o2等相关干扰物对检测没有影响；检测液ph值为7.4时，荧光强度为508nm(λex＝350nm)，探针yf可检测cys、hcy和gsh的总浓度(c
c+h+g
)。在ph值为7.4，通过以550nm为中心的荧光(λex＝475nm)，可以实现cys和hcy(c
c+h
)总浓度的检测。由于cys、hcy和gsh是生物液中含量最丰富的低分子量生物硫醇，在上述条件下探针yf的荧光强分别度与三种硫醇浓度呈良好的线性关系，因此通过简单的数学计算，可以同时定量检测血浆中cys、hcy和gsh的浓度。
29.(2)经过本发明的合成方法改进后，可以有效阻止副反应的发生，极大地减少反应过程中出现难以分离的杂质，从而可以得到高纯度的目标产物。
30.(3)本发明开发出了一种新型用于cys、hcy和gsh定量分析检测的荧光探针。应用到同时定量区分检测血浆中的cys、hcy和gsh的荧光探针，并且首次应用探针yf和荧光光谱仪进行荧光强度来同时定量区分检测血浆中的cys、hcy和gsh。利用荧光探针对血浆等生物液体中的半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽进行定量检测。为生物硫醇相关疾病的筛查和诊断以及生理和病理过程的分析提供一种快速、廉价的方法。
附图说明
31.图1为本发明实施例1中定量检测血浆中cys、hcy和gsh的新型荧光探针合成路线图；
32.图2为实施例1提供的荧光探针的荧光滴定图；横坐标为不同发射波长情况，纵坐标为荧光强度值；
33.图3为实施例1提供的荧光探针的选择性柱状图；横坐标为不同离子或分子添加情况，纵坐标为荧光强度值；
34.图4为本发明实施例1中溶液ph值对荧光探针与cys、hcy和gsh作用前和作用后荧光强度值的影响；横坐标为ph，纵坐标为荧光强度值；
35.图5为实施例1获得的荧光探针的动力学研究图；横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；
36.图6(a
‑
c)为实施例1获得的荧光探针检测血浆中生物硫醇的光谱数据图；横坐标为发射波长，纵坐标为荧光强度；图6(d
‑
f)为实施例1获得的荧光探针定量检测血浆中的cys、hcy和gsh的光谱数据来构建的荧光响应与cys体积的线性关系图；横坐标为cys的体积；纵坐标为荧光强度值(i
‑
i0)/i0，其中i0和i分别为探针yf单独检测液中的荧光强度和血
浆检测液中不同体积1
×
10
‑2m cys的荧光强度。
37.图7为探针yf同时定量区分检测cys,hcy和gsh示意图。
具体实施方式
38.以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
39.实施例1：
40.荧光探针的合成，具体步骤如下：
41.(1)向50ml烧瓶中加入1.1g的4
‑
(二乙氨基)水杨醛，用13ml正丁醇溶解，接着加入0.6ml硝基乙酸乙酯，搅拌均匀，再加入74μl哌啶，随后就加入0.26ml乙酸，将混合液在102℃加热回流搅拌反应11h；反应结束后冷却至室温，将沉淀物抽滤得到滤饼，沉淀物经正丁醇和石油醚洗涤提纯，真空干燥，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基橙色固体1.1g,产率为81％。
42.(2)将3ml盐酸溶液加到50ml烧瓶中，然后在冰浴环境下加入0.65g氯化亚锡，随后加入步骤1制备的0.21g 7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
硝基，常温搅拌，反应1.5h，在冰浴下加入氢氧化钠中和使得ph至7，用蒸馏水和乙酸乙酯对混合液进行萃取分液，将有机层回收，减压蒸馏除去多余的溶剂，之后用无水乙醇90℃重结晶，得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基76mg，产率为86％。
43.(3)称取步骤2得到的0.42g 7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
氨基溶于5.2ml盐酸，将混合液加热114℃回流搅拌反应3h；反应结束后，加入氨水中和使ph为7，用蒸馏水和二氯甲烷进行萃取分液，回收有机层，减压下去除有机溶剂。柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3:1,v/v)纯化得7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基黄色固体210mg，产率为70％。
44.(4)取0.33g步骤3得到的7
‑
(二乙氨基)香豆素
‑3‑
羟基和0.41g 4
‑
氯
‑7‑
硝基苯并
‑2‑
氧杂
‑
1,3
‑
二唑加入到4.8ml乙腈溶液中，接着加入0.26g碳酸钾，室温下搅拌反应4.5h，反应结束后，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3:1,v/v)，即可得到定量区分检测cys、hcy和gsh的新型荧光探针350mg，产率为68％。
45.实施例2：
46.实施例1获得的荧光探针对cys、hcy和gsh荧光检测的荧光光谱响应。
47.用20mm磷酸钾缓冲/dmso(4:1v/v，ph为7.4或5.6)配制5μm的荧光探针测试溶液，备用。用去离子水分别配制cys、hcy和gsh溶液的浓度为1
×
10
‑2m。分别随着不同浓度cys、hcy和gsh溶液加入到5μm荧光探针测试溶液中，激发波长分别为350nm和475nm，测试荧光发射光谱，其测定结果如图2所示。
48.从图2的结果中可以发现，在ph为7.4，激发波长为350nm时，在发射波长为508nm处的荧光强度，分别与0～60μm浓度范围内的cys、hcy和gsh呈良好的线性关系。yf探针可以检测cys、hcy和gsh的总浓度(c
c+h+g
)。当ph仍然为7.4，激发波长改为475nm时，在发射波长为550nm处的荧光强度，分别与0～60μm浓度范围内的cys或hcy呈线性关系。yf探针可以检测cys、hcy的总浓度(c
c+h
)。当ph值改为5.6，激发波长仍然为475nm，在发射波长为550nm处可检测出cys的浓度。分别与0～300μm浓度范围内的cys呈线性关系；yf探针可以检测cys的总浓度(c
c
)。该结果表明：该荧光探针对cys、hcy和gsh具有很好的荧光响应。
49.实施例3：
50.实施例1获得的荧光探针对cys、hcy和gsh荧光检测的选择性。
51.按照实施例2配制测试溶液，用去离子水配制各种被测物(lys，arg，ser，leu，phe，ala,gly，glu，val，gln，k
+
，na
+
，mg
2+
，zn
2+
，h2o2)溶液的浓度为1
×
10
‑2m。先分别加入12当量的其它可能干扰物到5μm的荧光探针分子测试溶液中，包括空白,lys，arg，ser，leu，phe，ala,gly，glu，val，gln，k
+
，na
+
，mg
2+
，zn
2+
，h2o2，再往这些溶液中分别加入12当量的cys、hcy和gsh。混合10分钟后，在同样条件下分别以350nm和475nm为激发波长，进行荧光光谱测试，得到各组溶液的荧光光谱。
52.从图3的结果中可以发现，当体系加入lys，arg，ser，leu，phe，ala,gly，glu，val，gln，k
+
，na
+
，mg
2+
，zn
2+
，h2o2等可能干扰物后，在ph为7.4的检测液下，激发波长为350nm时，只有加入半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽才能获得显著的荧光增强。而相同ph条件下激发波长为475nm时，只观察到cys和hcy的荧光增强。当检测液ph值为5.6，激发波长为475nm时，探针yf能够选择性地响应cys。该结果表明：高选择性的荧光响应表明，探针yf可用于复杂生物环境中cys、hcy和gsh的检测，不受其它共存离子或分子的干扰。
53.实施例4：
54.ph对实施例1获得的荧光探针检测cys、hcy和gsh的影响。
55.由于检测液的ph值是定量鉴别cys、hcy和gsh的关键因素之一，因此研究了探针分子在不同ph条件下对cys、hcy和gsh的响应，首先分别配制了不同ph(2
‑
12)的磷酸缓冲液。依次测定ph从2
‑
12体系下实施例1获得的荧光探针的荧光光谱，如图4。可以看到探针yf本身的荧光几乎不受ph变化的影响；而在引入cys、hcy和gsh后，探针yf在ph 4.0～10.0范围内，在508nm(λex＝350nm)处荧光增强明显。可以检测cys、hcy和gsh(c
c+h+g
)的总浓度；然后，将激发波长改为475nm，经过cys和hcy处理后，探针yf在ph分别为5.0～11.0和5.7～11.0时，在550nm处荧光增强。此外，探针yf处理gsh后在550nm处几乎没有荧光增强。因此，在ph 7.4的检测液中可以检测到cys和hcy(c
c+h
)的总浓度，在ph 5.6的检测液中可以检测到cys(c
c
)的浓度。
56.实施例5：
57.实施例1获得的荧光探针的动力学研究。
58.研究了探针yf对cys、hcy和gsh的动力学分布。检测液ph保持在7.4，激发波长为350nm，探针yf本身在508nm处荧光强度没有明显变化。在分别加入cys、hcy或gsh处理下，508nm(λex＝350nm)的荧光在5分钟内显著增强，表明对三种生物硫醇的快速响应。此外，在ph为7.4，激发波长为475nm的条件下，只有cys和hcy表现出快速的荧光增强，而gsh几乎没有荧光反应。此外，当检测液ph值为5.6，激发波长仍保持在475nm时，只有cys在550nm处产生快速荧光响应。这些结果表明，探针yf对cys、hcy或gsh反应迅速，从而能够实时检测cys、hcy或gsh。
59.实施例6：
60.实施例1获得的荧光探针的实际应用。
61.(1)实施例1获得的荧光探针检测血浆中的硫醇。
62.取健康志愿者静脉血3.0ml。血样置于预冷的乙二胺四乙酸(edta)真空管中，立即在4℃下2500r/min离心10min。上清液作为人血浆进行分析。移取0.025ml荧光探针母液(1
×
10
‑3m)和1ml dmso于5ml容量瓶中，分别加入人血浆样品(0μl,50μl,100μl,150μl,200μl,
250μl或300μl)，然后分别用20mm的磷酸盐缓冲剂(ph＝7.4或ph＝5.6)定容到5ml，摇匀，室温放置10min后，然后将混合溶液移入石英比色皿中，在350nm或475nm激发后，用荧光分光光度计记录溶液的荧光光谱。
63.为确定探针yf在生物液中的实用性，首次将探针yf用于监测人血浆中cys、hcy和gsh水平。如图6(a
‑
c)所示,从左至右可以看出，分别加入不同体积(0μl,50μl,100μl,150μl,200μl,250μl或300μl)的血浆样品时，测定溶液的ph值在7.4或5.6，激发波长在350nm或475nm下,荧光强度逐渐增强，以上结果表明，该发明的荧光探针可以检测血浆中的cys、hcy和gsh。
64.(2)实施例1获得的荧光探针同时定量检测血浆中的cys、hcy和gsh。
65.取数个5ml容量瓶，每个都加入0.025ml荧光探针分子母液(1
×
10
‑3m)和100μl血浆样品，再分别加入不同体积1
×
10
‑2m的cys溶液(0、2.5、5、7.5、10、15、20μl),然后分别用20mm的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4或ph＝5.6)定容到5ml，摇匀，室温放置10min后，然后用荧光分光光度计记录荧光光谱，荧光激发波长分别为350nm或475nm。
66.如图6(d
‑
f)所示，采用以半胱氨酸(cys)为标准的标准加标法，检测血浆样品中未知水平的半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy)和谷胱甘肽(gsh)。通过计算得到血浆样品中cys、hcy和gsh的总浓度为147.6μm；检测到cys和hcy的总浓度为126.7μm；cys的浓度为118.3μm。由此计算出cys、hcy和gsh的浓度分别为118.3μm、8.4μm、20.9μm，符合健康人血浆中cys、hcy和gsh的浓度范围。因此，探针yf可以定量检测人血浆中cys、hcy和gsh。
67.综上所述，我们合理设计并合成了一种新型荧光探针，该探针能够在不同ph和不同荧光通道中对cys、hcy和gsh进行检测。结果表明，在ph为7.4，激发波长为350nm时，在发射波长为508nm处可检测到cys、hcy和gsh的总浓度；当ph仍然为7.4，激发波长改为475nm时，在发射波长为550nm处可检测到cys和hcy的总浓度；当ph值改为5.6，激发波长仍然为475nm，在发射波长为550nm处可检测出cys的浓度。然后通过简单的数学计算，可以同时定量区分检测血浆中cys、hcy和gsh的含量。