1.本发明涉及蜂毒肽制备技术领域，尤其涉及一种高纯度蜂毒肽及其制备方法。
背景技术：
2.蜂毒肽(melittin，mlt)是蜂毒中的主要活性成分，由26个氨基酸残基组成，约占蜂毒干重的50％左右。蜂毒肽作为典型的抗菌肽，具有镇痛、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理活性，具有较高的科学研究价值和广泛的医疗应用价值。
3.蜂毒是一种复杂的混合物，其中含有的大分子量的酶类物质容易造成过敏，小分子量的胺类物质容易造成疼痛，因此，去除这些物质，提高蜂毒肽的纯度，对于蜂毒在临床上的推广应用具有重要意义。但是，目前蜂毒肽纯化过程中涉及的工艺步骤繁琐，操作复杂，纯化过程中蜂毒肽损失严重，使得蜂毒肽的制备成本较高，阻碍了蜂毒肽的进一步开发和应用。
4.目前，高纯度蜂毒肽的制备方法有：将蜂毒肽溶于水后，离心分离，向离心液中加入乙醇去除沉淀、正丁醇萃取、乙醇二次去除沉淀，得到的粗蜂毒水溶液经多次葡聚糖凝胶柱色谱纯化、超滤、冷冻干燥，得到蜂毒肽，蜂毒肽的含量在45.34％
‑
87.83％，蜂毒肽的含量较低，且制备方法繁琐，生产成本较高。因此，研发一种操作简单、蜂毒肽的收率和纯度均较高的高纯度蜂毒肽的制备方法，对于扩大蜂毒肽在医药领域的进一步开发和应用具有十分重要的意义。
技术实现要素：
5.针对现有制备蜂毒肽的方法存在的操作繁琐、成本高，以及制备得到的蜂毒肽的收率和纯度较低的问题，本发明提供一种高纯度蜂毒肽及其制备方法，其主要通过将蜂毒水溶液离心后在特定ph除杂、超滤，以及制备色谱进行分离纯化，有效提高了蜂毒肽的纯度。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
7.一种高纯度蜂毒肽的制备方法，包括如下步骤：
8.步骤a，将蜂毒粗品加入纯化水中，分散均匀，离心，得蜂毒离心液；
9.步骤b，调节所述蜂毒离心液的ph为3.0～4.0，静置1h～2h，过滤，得第一滤液；然后调节所述第一滤液的ph为4.5～5.5，过滤，得第二滤液；
10.步骤c，将所述第二滤液用截留分子量500da～1000da的超滤膜进行超滤浓缩，收集滤余液，得蜂毒超滤液；
11.步骤d，将所述蜂毒超滤液经反相高效液相制备色谱进行分离纯化，收集目标组分，合并蜂毒肽hplc纯度大于99％的洗脱液；其中，所述制备色谱柱为dac
‑
100，填料为聚苯乙烯微球，流动相a为三氟乙酸水溶液，流动相b为含三氟乙酸的甲醇溶液或含三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱；
12.步骤e，将所述蜂毒肽洗脱液用截留分子量500da～1000da的超滤膜进行超滤浓
缩，收集滤余液，冻干，得蜂毒肽产品。
13.相对于现有技术，本发明提供的高纯度蜂毒肽的制备方法，通过将蜂毒粗品溶于纯化水后离心去除水不溶杂质，然后调节离心液的ph为3.0～4.0，可使蜂毒粗品中的部分杂质在此ph条件下沉淀除去，同时此ph条件还可使病毒灭活，再将ph调节为4.5～5.5，有利于提高蜂毒的稳定性；再经超滤浓缩的方法除去离子以及组胺等小分子杂质后，以填料为聚苯乙烯微球的dac
‑
100色谱柱进行制备色谱纯化分离，最终得到含量可达99％以上的高纯度蜂毒肽。
14.本发明仅通过离心、调节ph以及超滤、制备色谱分离等简单工艺就可将蜂毒粗品中的致敏物质和无效杂质分离除去，有利于实现快速、大量生产精制蜂毒产品的目的，产品纯度可达到99％以上，提高了临床用药的安全性，且无需经过葡聚糖凝胶柱多次纯化，有效简化了蜂毒肽的制备工艺，降低了成本低，具有极高的推广应用价值。
15.本发明中所述制备色谱柱优选江苏汉邦科技有限公司生产的型号为dac
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100(100mm*250mm)制备柱；其填料优选为聚苯乙烯微球uni ps 20
‑
300。
16.优选的，步骤a中，所述蜂毒粗品与纯化水的质量比为1：8～10。
17.优选的蜂毒粗品于纯化水的比例，可使蜂毒充分溶解，并尽可能多地除去水不溶性杂质，提高蜂毒肽的纯度。
18.优选的，步骤a中，离心的转速为4000r/min～6000r/min，离心时间为15min～30min。
19.优选的离心转速和离心时间，可尽量多地除去水不溶性杂质。
20.可选的，步骤b中，选择1.0mol/l盐酸溶液调节所述蜂毒离心液的ph为3.0～4.0。
21.优选的酸性条件，可以使病毒灭活，同时可尽可能多地使蜂毒粗品中的杂质沉淀析出。
22.可选的，步骤b中，选择1.0mol/l氢氧化钠溶液调节ph为4.5～5.5。
23.优选的ph值有利于提高蜂毒肽在纯化过程的稳定性保证精制蜂毒肽产品的质量稳定。
24.可选的，步骤b中，第一滤液调节ph为4.5～5.5后，采用0.45μm的滤膜。
25.优选的，步骤c中，超滤浓缩时，待滤余液体积为所述第二滤液体积的30％～40％时，停止浓缩。
26.优选的滤液体积，有利于提高蜂毒肽的纯度和收率，同时，还有利于提高后续高效液相制备色谱分离纯化的效率。
27.优选的，步骤c中，超滤的压力为0.4mpa～0.8mpa。
28.优选的操作压力，既可使杂质具有较高的透过率又具有较高的膜通量，同时还可避免压力过大导致的膜污染，提高超滤效率。
29.优选的，步骤d中，所述聚苯乙烯微球的粒径为20μm，孔径为
30.优选的，步骤d中，所述梯度洗脱的顺序为：
31.0min流动相a 65％～60％，流动相b 35％～40％；
32.15min流动相a 50％～45％，流动相b 50％～55％。
33.优选的，步骤d中，流速为280ml/min～320ml/min。
34.优选的，步骤d中，所述流动相a中三氟乙酸的体积百分含量为0.05％
‑
0.2％。
35.优选的，步骤d中，所述流动相b中三氟乙酸的体积百分含量为0.05％
‑
0.2％。
36.在高效液相制备色谱分离纯化过程中，各色谱条件的选择及其组合很重要，其直接影响各组分之间的分离度以及出峰时间等。本发明优选的色谱条件，有利于将蜂毒肽与杂质进行有效分离，在较短的时间内取得较好的分离效果。
37.优选的，步骤e中，超滤浓缩时，待滤余液体积与步骤c中所得蜂毒超滤液体积相同时，停止浓缩。
38.优选的滤余液体积有利于后续对蜂毒肽进行冻干，缩短冻干时间，并获得物理形态良好、表面平整的蜂毒肽产品。
39.优选的，步骤e中，超滤的压力为0.4mpa～0.8mpa。
40.优选的操作压力，可提高超滤效率，缩短浓缩时间，从而提高蜂毒肽的生产效率。
41.可选的，步骤c和步骤e中，超滤于室温条件下。
42.进行本发明还提供了一种高纯度蜂毒肽，由上述任一项所述的高纯度蜂毒肽的制备方法制得。
43.本发明通过简单工艺有效提高了蜂毒肽的纯度，使蜂毒肽纯度达99％以上，从而提高了蜂毒肽的临床应用的安全性，适合工业化规模生产，对于扩大蜂毒肽在医药领域的开发和应用具有十分重要的意义，市场前景广阔。
具体实施方式
44.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
45.为了更好的说明本发明，下面通过实施例做进一步的举例说明。
46.以下实施例中所使用的聚苯乙烯微球uni ps 20
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300、甲基丙烯酸酯微球uni pmm 20
‑
500均购自苏州纳微科技有限公司。所用的制备色谱柱为江苏汉邦科技有限公司生产的型号为dac
‑
100(100mm*250mm)的制备柱。
47.以下实施例和对比例中所使用的蜂毒粗品中蜂毒肽的含量为46.7％。
48.实施例1
49.本实施例提供一种高纯度蜂毒肽的制备方法，包括如下步骤：
50.步骤a，将25g蜂毒粗品加入250g纯化水中，分散均匀，以4000r/min的转速离心30min，离心结束后取上清液，得蜂毒离心液；
51.步骤b，用0.1mol/l盐酸溶液调节所述蜂毒离心液的ph为3.5，室温静置1.5h，过滤，得第一滤液；然后用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节所述第一滤液的ph为5.5，经0.45μm滤膜过滤，得第二滤液；
52.步骤c，将所述第二滤液用截留分子量为1000da的超滤膜进行超滤浓缩，超滤压力为0.4mpa，待滤余液体积为所述第二滤液体积的30％时，停止浓缩，收集滤余液，得蜂毒超滤液；
53.步骤d，将所述蜂毒超滤液经制备色谱柱进行分离纯化，收集目标组分，检测主峰洗脱液的hplc纯度，收集并合并hplc纯度大于99％的洗脱液，得蜂毒肽洗脱液；
54.其中，制备色谱分离纯化的条件如下所示：
55.色谱柱：dac
‑
100，填料为聚苯乙烯微球uni ps 20
‑
300；
56.检测波长：220nm；
57.流动相a：0.05％的三氟乙酸水溶液；
58.流动相b：含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液；
59.流速：300ml/min；
60.梯度洗脱，洗脱顺序为：
61.0min流动相a 65％，流动相b 35％；
62.15min流动相a 50％，流动相b 50％。
63.步骤e，将所得蜂毒肽洗脱液用截留分子量1000da的超滤膜进行超滤浓缩，超滤压力为0.4mpa，待滤余液体积与步骤c中所得蜂毒超滤液的体积相同时，停止超滤，收集滤余液，冻干，得蜂毒肽冻干粉7.9g，蜂毒肽含量为99.3％。
64.实施例2
65.本实施例提供一种高纯度蜂毒肽的制备方法，包括如下步骤：
66.步骤a，将25g蜂毒粗品加入200g纯化水中，分散均匀，以5000r/min的转速离心20min，离心结束后取上清液，得蜂毒离心液；
67.步骤b，用0.1mol/l盐酸溶液调节所述蜂毒离心液的ph为3.0，室温静置1h，过滤，得第一滤液；然后用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节所述第一滤液的ph为4.5，经0.45μm滤膜过滤，得第二滤液；
68.步骤c，将所述第二滤液用截留分子量为1000da的超滤膜进行超滤浓缩，超滤压力为0.6mpa，待滤余液体积为所述第二滤液体积的35％时，停止浓缩，收集滤余液，得蜂毒超滤液；
69.步骤d，将所述蜂毒超滤液经制备色谱柱进行分离纯化，收集目标组分，检测主峰洗脱液的hplc纯度，收集并合并hplc纯度大于99％的洗脱液，得蜂毒肽洗脱液；
70.其中，制备色谱分离纯化的条件如下所示：
71.色谱柱：dac
‑
100，填料为聚苯乙烯微球uni ps 20
‑
300；
72.检测波长：220nm；
73.流动相a：0.2％的三氟乙酸水溶液；
74.流动相b：含0.2％三氟乙酸的乙腈溶液；
75.流速：280ml/min；
76.梯度洗脱，洗脱顺序为：
77.0min流动相a 60％，流动相b 40％；
78.15min流动相a 45％，流动相b 55％。
79.步骤e，将所得蜂毒肽洗脱液用截留分子量1000da的超滤膜进行超滤浓缩，超滤压力为0.6mpa，待滤余液体积与步骤c中所得蜂毒超滤液的体积相同时，停止超滤，收集滤余液，冻干，得蜂毒肽冻干粉8.1g，蜂毒肽含量为99.1％。
80.实施例3
81.本实施例提供一种高纯度蜂毒肽的制备方法，包括如下步骤：
82.步骤a，将25g蜂毒粗品加入225g纯化水中，分散均匀，以6000r/min的转速离心15min，离心结束后取上清液，得蜂毒离心液；
83.步骤b，用0.1mol/l盐酸溶液调节所述蜂毒离心液的ph为4.0，室温静置2h，过滤，得第一滤液；然后用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节所述第一滤液的ph为5.0，经0.45μm滤膜过滤，得第二滤液；
84.步骤c，将所述第二滤液用截留分子量为500da的超滤膜进行超滤浓缩，超滤压力为0.8mpa，待滤余液体积为所述第二滤液体积的30％时，停止浓缩，收集滤余液，得蜂毒超滤液；
85.步骤d，将所述蜂毒超滤液经高效反相液相制备色谱柱进行分离纯化，收集目标组分，检测主峰洗脱液的hplc纯度，收集并合并hplc纯度大于99％的洗脱液，得蜂毒肽洗脱液；
86.其中，制备色谱分离纯化的条件如下所示：
87.色谱柱：dac
‑
100，填料为聚苯乙烯微球uni ps 20
‑
300；
88.检测波长：220nm；
89.流动相a：0.1％的三氟乙酸水溶液；
90.流动相b：含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；
91.流速：320ml/min；
92.梯度洗脱，洗脱顺序为：
93.0min流动相a 62％，流动相b 38％；
94.15min流动相a 47％，流动相b 53％。
95.步骤e，将所得蜂毒肽洗脱液用截留分子量500da的超滤膜进行超滤浓缩，超滤压力为0.8mpa，待滤余液体积与步骤c中所得蜂毒超滤液的体积相同时，停止超滤，收集滤余液，冻干，得蜂毒肽冻干粉8.3g，蜂毒肽含量为99.0％。
96.对比例1
97.本对比例提供一种高纯度蜂毒肽的制备方法，其步骤与实施例1完全相同，不同的仅是步骤b中，所述蜂毒离心液不调整ph，蜂毒离心液的原溶液ph为4.95，直接将蜂毒离心液进行步骤c中的超滤操作以及后续的步骤d和步骤e。
98.制备所得蜂毒肽为5.8g，蜂毒肽含量为99.1％。
99.对比例2
100.本对比例提供一种高纯度蜂毒肽的制备方法，其步骤与实施例1完全相同，不同的仅是步骤d中将dac
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100色谱柱的填料替换为甲基丙烯酸酯微球unipmm 20
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500，其余条件完全相同。
101.检测主峰洗脱液的hplc纯度，最高纯度为93.5％，因此，收集并合并主峰hplc纯度大于93％的洗脱液。
102.制备所得蜂毒肽为7.2g，蜂毒肽含量为93.2％。
103.对比例3
104.本对比例提供一种高纯度蜂毒肽的制备方法，其步骤与实施例1完全相同，不同的仅是步骤d中制备色谱分离纯化条件中的流动相替换为三氟乙酸
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乙腈
‑
水，三氟乙酸的体积百分含量为0.05％，乙腈和水的体积比为42:58，进行等度洗脱，洗脱时间为15min，其余条件完全相同。制备所得蜂毒肽为4.2g，蜂毒肽含量为99.0％。
105.以上实施例和对比例中，用于分析制备的蜂毒肽含量的hplc分析条件如下：
106.色谱柱：agilent zorbax 300sb
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c8(4.6*250mm，5μm)；
107.流动相a：0.1％的三氟乙酸水溶液；
108.流动相b：含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；
109.梯度洗脱，洗脱顺序如下：
110.时间(min)流动相a％流动相b％0.0165.035.015.0050.050.015.0165.035.020.0065.035.0
111.检测波长：220nm；
112.流速：1.0ml/min。
113.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。