预测直肠癌患者对贝伐单抗敏感性的生物标志物的制作方法

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及预测直肠癌患者对贝伐单抗敏感性的生物标志物。


背景技术：

2.直肠癌(rectal cancer)是指发生在直肠齿状线以上至直肠、乙状结肠交界处的恶性肿瘤。中国直肠癌发病部位80％以上发生在近肛门处，多能通过直肠指检发现。直肠癌的病因尚不明确，多数直肠癌由腺瘤性息肉演变而来，经历增生、腺瘤、癌变各阶段及相应的染色体改变，癌变涉及多基因参与。虽然其病因未明确，但其相关的高危因素逐渐被认识。
3.直肠癌的治疗应采取个体化综合治疗的原则，医生会根据患者的身体状态、肿瘤的病理类型、侵犯范围(分期)，有计划地应用多种治疗手段，以期最大程度地根治肿瘤，提高治愈率。直肠癌的全系膜切除(total mesorectal excision，tme)手术最早由英国的heald提出，目前已经成为直肠癌的标准治疗术式。局部晚期直肠癌(larc)患者的标准治疗方法是放化疗(crt)，然后进行全系膜切除手术。通过这种治疗，30％的患者将在治疗结束后5年内死于局部和远处复发。为了克服这个问题，迫切需要加强术前治疗。
4.贝伐单抗(bevacizumab，avastin，阿瓦斯汀)是重组的人源化单克隆抗体。2004年2月26日获得fda的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。目前研究表明，igg1抗体能通过体内、体外检测系统与人血管内皮生长因子(vegf)结合并阻断贝伐单抗的生物活性。最初贝伐单抗适用于大肠癌的治疗，近年来在直肠癌患者中获得了贝伐单抗抗血管生成的直接证据，抗血管生成药物和crt的这种组合可能优于单独的个体治疗。但是贝伐单抗对直肠肿瘤的确切作用尚未完全阐明，患者对贝伐单抗的敏感性也难以预测。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预测直肠癌患者对贝伐单抗敏感性的标志物及其应用。本发明所提供的标志物对于预测直肠癌患者对贝伐单抗的敏感性具有较高的灵敏度和特异性，可作为指导术前治疗方案的新型标志物。
6.预测方法
7.一方面本发明提供了检测rnf34、dtd2、asmtl中一个或多个的表达量的试剂在制备预测受试者对贝伐单抗敏感性的产品中的应用。
8.所述rnf34在对贝伐单抗敏感的患者中高表达。
9.所述dtd2在对贝伐单抗敏感的患者中低表达。
10.所述asmtl在对贝伐单抗敏感的患者中低表达。
11.优选地，所述高表达指标志物表达水平大于其在健康对照群体中的表达水平，相对于对照表达水平高至少1.1倍，例如至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7
倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍或更多。
12.本发明所述“敏感性”，即患者的疾病情况是否可以通过贝伐单抗治疗而得到改善；优选地，达到完全缓解(complete remission，cr)。在进行预测时，只要在施用贝伐单抗前，测量来着受试者的样本中的标志物表达量即可判断。
13.如本文中所使用的，术语“施用”意指通过本领域中已知的适合于施用治疗性抗体的任何手段对需要此类治疗或医学干预的患者施用贝伐单抗。非限制性施用路径包括通过口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、皮内、鼻内或支气管内(例如通过吸入实现的)路径。
14.优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。
15.优选地，所述受试者为人。
16.优选地，所述受试者是直肠癌患者。
17.更优选地，所述受试者是晚期直肠癌患者。
18.优选地，所述检测表达量的试剂包括检测mrna表达量和/或蛋白表达量的试剂。
19.优选地，所述检测包括定量或定性的检测。
20.优选地，所述检测mrna表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于pcr原理的检测方法、southern杂交方法、northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、dna微阵列方法、aso法、高通量测序平台方法。
21.优选地，所述基于pcr原理的检测方法包括以下至少任意一种：将提取rna的步骤、mrna逆转录为cdna的步骤、测量cdna的含量的步骤。
22.优选地，所述测量cdna的含量的方法包括但不限于pcr、nasba、rpa、sda、lamp、had、near、mda、rca、lcr、ram。
23.优选地，所述检测mrna表达量的试剂包括特异性引物和/或探针。
24.优选地，所述探针包括杂交型探针和水解型探针(taqman探针)。
25.优选地，所述探针的两端连接有淬灭基团和/或荧光基团。
26.优选地，所述荧光基团包括但不限于fam(羧基荧光素，carboxy fluorescein，绿色荧光)、fitc(异硫氰酸荧光素，fluorescein isothiocyanate)、tet(四氯
‑6‑
羧基荧光素，tetrachloro fluorescein)、hex(六氯
‑6‑
甲基荧光素，hexachloro fluorescein)、joe(2，7
‑
二甲基
‑
4，5
‑
二氯
‑6‑
羧基荧光素)、罗丹明类(rhodamine染料如r110，tamra、texas red等)、rox、alexafluor染料、atto染料、dylight染料、cyanine染料(如cy2，cy3，cy3.5，cy3b，cy5，cy5.5，cy7，cy7.5)、fluoprobes染料、sulfocy染料、seta染料、iris染料、setau染料、srfluor染料、square染料。
27.优选地，本文所述淬灭基团包括但不限于3'
‑
bbq
‑
650(black berry quencher650)、bhq
‑
0(black hole quencher 0，3')、bhq
‑
1(black hole quencher 1，3')、bhq
‑
2(black hole quencher 2，3')、bhq
‑
3(black hole quencher 3，3')、bhq
‑
1(black hole quencher
‑
1，5')、bhq
‑
2(black hole quencher
‑
2，5')、bhq
‑
3(black hole quencher
‑
3，5')、atto 540q、atto 575q、atto 612q。
28.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹
(western blot)法、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射性免疫测定(ria)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
29.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括特异性抗体或其片段，所述特异性抗体或其片段能特异性的与蛋白结合。
30.优选地，所述检测蛋白表达量的试剂还包括二抗，所述二抗能与前述的特异性抗体或其片段结合并且显色。
31.优选地，所述显色通过显色剂体现，所述显色剂包括但不限于荧光染料(包括荧光分子)、化学发光标记物、荧光素酶、金属离子、生物素、放射性同位素、在uv光谱中进行吸收的分子、在近红外辐射中能够进行吸收的分子或远红外辐射中能够进行吸收的分子。
32.优选地，所述荧光染料包括但不限于罗丹明、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯代对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚、氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明、以及硫代罗丹明、菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁、噻碳菁、部花青、菁染料。
33.优选地，所述化学发光标记物包括但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、水母发光蛋白、官能化的铁
‑
卟啉衍生物、鲁米那、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、磺酰胺等。
34.优选地，所述荧光素酶包括但不限于长腹水蚤(gaussia)荧光素酶、海肾(renilla)荧光素酶、腰鞭毛虫荧光素酶、萤火虫荧光素酶、真菌荧光素酶、细菌荧光素酶和弯喉萤(vargula)荧光素酶。
35.优选地，所述的抗体或其片段还可以直接与显色剂结合，检测到所述显色剂显示就表示蛋白有表达。
36.优选地，所述产品中还包括收集和/或处理样品的试剂。
37.优选地，所述样品包括：血液、血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、鼻上皮细胞、痰、组织、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
38.优选地，所述样品是组织。
39.优选地，所述组织样品可以通过活组织检查获得，例如包括通过切割、切片、手术或穿孔获得。
40.试剂盒
41.另一方面本发明提供了一种预测受试者对贝伐单抗敏感性的试剂盒，所述试剂盒包括前述检测受试者的rnf34、dtd2、asmtl中一个或多个的表达量的试剂。
42.优选地，所述试剂盒中还可以包含以下任意一种或多种：mrna表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测试剂、mrna表达量辅助检测仪器、蛋白表达量辅助检测仪器。
43.优选地，所述mrna表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂，rna提取试剂，逆转录试剂，cdna扩增试剂，制备标准曲线所用的标准品，阳性对照品，阴性对照品。
44.优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液，抗体稀释液，洗涤
缓冲液，显色终止液，制备标准曲线的标准品。
45.系统
46.另一方面，本发明提供了一种预测受试者对贝伐单抗敏感性的产品中的系统，所述系统包括根据受试者rnf34、dtd2、asmtl中一个或多个的表达量的检测结果判断受试者对贝伐单抗敏感性的计算装置。
47.优选地，所述系统包括用于输入rnf34、dtd2、asmtl中一个或多个的表达量的输入装置。
48.优选地，所述系统还可以包括用于输出预测结果的输出装置。
49.优选地，所述系统还可以包括检测mrna和/或蛋白表达量的检测装置。
50.优选地，所述系统还包括评估结果发送单元，所述评估结果发送单元可以将受试者的评估结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。
51.标志物组合
52.另一方面，本发明提供了一种标志物组合，所述标志物组合是rnf34+dtd2或rnf34+asmtl或dtd2+asmtl。
53.同时本发明提供了以上试剂盒、系统、标志物组合在制备预测受试者对贝伐单抗敏感性的产品中的用途。
54.方法
55.另一方面本发明提供一种预测受试者对贝伐单抗敏感性的产品中的方法，所述方法包括通过受试者rnf34、dtd2、asmtl中一个或多个的表达量的检测结果判断受试者对贝伐单抗的敏感性。
56.优选地，所述方法是在使用贝伐单抗之前，检测来着受试者样品的rnf34、dtd2、asmtl中一个或多个的表达量，从而判断受试者对贝伐单抗的敏感性。
57.如本文中所使用的，术语“贝伐单抗”涵盖满足在选自美国、欧洲和日本的国家或地区中获得作为相同或生物学相似产品的销售授权必需的要求的所有相应的抗vegf抗体或抗vegf抗体片段。
附图说明
58.图1为差异分析结果图，a：rnf34，b：dtd2，c：asmtl，纵坐标为基因表达量。
59.图2为rnf34在预测受试者对贝伐单抗敏感性中的roc曲线，纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
60.图3为dtd2在预测受试者对贝伐单抗敏感性中的roc曲线，纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
61.图4为asmtl在预测受试者对贝伐单抗敏感性中的roc曲线，纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
62.图5为rnf34+dtd2在预测受试者对贝伐单抗敏感性中的roc曲线，纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
63.图6为rnf34+asmtl在预测受试者对贝伐单抗敏感性中的roc曲线，纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
64.图7为dtd2+asmtl在预测受试者对贝伐单抗敏感性中的roc曲线，纵坐标是敏感
度，横坐标是特异性。
具体实施方式
65.以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。
66.实施例1、筛选预测标志物
67.1、数据下载及实验对象
68.从geo数据库下载gse60331的基因表达数据，具体链接是https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/e
‑
geod
‑
60331/？query＝gse60331+。
69.在以上数据库的研究中，59名患者在接受贝伐单抗治疗前留存了肿瘤组织，在后期接受全系膜切除(total mesorectal excision，tme)手术治疗时，根据患者的治疗情况按照dworak/五级分级将患者分为两组：完全缓解组(complete remission，cr)也称为反应者在数据库中标记为r，治疗失败组(non
‑
responders，nr)也称为无反应者在数据库中标记为nr。
70.最终收集到反应者21份样本，无反应者26个样本；另外，重复检测nj 04/003t1、rvs 09/002m、nj 04/003w3这三个样品以排除批次效应。最终nr：r＝27:23。
71.2、数据分析
72.获得测序结果后，使用r软件中的“limma”包进行差异表达分析，差异基因的筛选标准为p value<0.01。在此标准下，geo中差异表达的基因有173个；其在rnf34、dtd2、asmtl的基因表达情况如表1所示，差异分析结果图如图1所示。
73.表1.基因表达情况
[0074] logfc平均表达量p.valueasmtl
‑
0.2068035770.4536417930.000259249dtd2
‑
0.1252883211.1222781370.000635701rnf340.0544722130.0668043220.005948679
[0075]
实施例2、验证标志物、标志物组合的预测效果
[0076]
使用r语言proc包绘制受试者工作曲线(roc)，计算auc值、敏感性和特异性，判断标志物的预测效能。rnf34、dtd2、asmtl、rnf34+dtd2、rnf34+asmtl、dtd2+asmtl的roc曲线依次如图2
‑
7所示，auc值如表2所示。
[0077]
表2.标志物或标志物组合的auc值
[0078]
标志物/组合aucrnf340.755233494dtd20.768115942asmtl0.792270531asmtl_rnf340.818035427asmtl_dtd20.903381643rnf34_dtd20.84057971
[0079]
以上结果说明本发明所提供的标志物可以预测直肠癌患者对贝伐单抗敏感性，具
有较高的临床应用价值。
[0080]
以上仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。