一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法与流程

1.本发明属于菌种鉴定技术领域，尤其涉及一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法。


背景技术：

2.冬虫夏草作为一种传统的名贵中药材在中国已有上千年的历史，主产于青藏高原及其横断山区，具有补肺益肾、止血化痰、止咳定喘之功效，与人参、鹿茸共称为“中华三宝”。
3.由于天然冬虫夏草资源日益匮乏，且人工养殖冬虫夏草难以在市场中普及，目前对发酵虫草制剂的相关研究大多集中于产品的化学成分、药理作用等方面，对虫草发酵类产品的菌种及其菌株专一性的研究较少。该类产品的原料是发酵菌粉，发酵菌粉是由从冬虫夏草中提取分离的菌种经深层发酵培养而来，不同菌种发酵成不同菌粉，从而生产出不同发酵虫草制剂。因此提取分离的菌种是源头，其纯度如何，直接影响发酵虫草制剂的质量。而在菌种传代发酵培育过程中，如何保证该菌种的菌株在生产周期内的稳定而不发生菌株变异，是保证产品质量的根本，这些目前尚未见国内外相关文献报道。
4.中国被毛孢菌是百令胶囊或百令片的原料
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发酵冬虫夏草菌粉的菌种来源。发酵冬虫夏草菌粉是百令胶囊/片/颗粒的原料药，为新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草菌[cordyceps sinensis(berk.)sacc.]的无性世代中国被毛孢经液体发酵培养所得菌丝体的干燥粉末。菌种鉴定多采用显微形态鉴别，主要从分生孢子的形态、菌落颜色及有无隔膜和菌环等进行描述。分子生物学技术用于虫草菌菌种的鉴定虽然有文献报道，但实际应用于菌种鉴定较少。究其原因，一方面，尚未建立专属性强、操作简便的分子鉴定检验标准，另一方面，企业从成本核算的角度考虑，更偏向于显微形态鉴定。
[0005]
基于上述情况，我们提出了一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法，该方法从分子水平对制剂及原料药的真菌来源即中国被毛孢菌进行了准确、专属的鉴定，保证了菌种、原料药到制剂的菌种专一性和稳定性，即保证菌种在生产传代过程中不发生变异，进而保证菌种和原料药及制剂的质量稳定与可控。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法。
[0007]
一种中国被毛孢菌的引物，所述特异性引物为5’caccacagcagttgcct 3’和5’tcatttgcttgcttcttgactg 3’。
[0008]
一种中国被毛孢菌的探针，所述探针为5’cctgtcgcagtggcatctct 3’。
[0009]
本发明提供一种所述的引物和探针在制备检测中国被毛孢菌的试剂盒中的用途。
[0010]
本发明提供一种所述的引物和探针的试剂盒。
[0011]
本发明提供一种试剂盒检测中国被毛孢菌的用途。
[0012]
一种中国被毛孢菌的鉴定方法，所述中国被毛孢菌的鉴定方法的pcr反应总体系
为25μl，反应体系包括10
×
buffer缓冲液2.5μl，dntp(10mmol/l)1.0μl，引物(50μmol/l)各0.2μl，探针0.2μl，taq dna聚合酶(5u/μl)0.15μl，模板2μl，无菌超纯水18.75μl。
[0013]
进一步地，所述pcr反应在95℃预变性5分钟，循环反应40次，其中95℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，得到扩增曲线。
[0014]
本发明的有益效果为：
[0015]
本发明设计特异性引物和探针，优选后建立中国被毛孢菌、发酵冬虫夏草菌丝体及百令胶囊/片等各样品实时荧光pcr鉴别方法，从分子水平解决了发酵虫草类药材的真菌菌种鉴别难题。
附图说明
[0016]
图1百令胶囊的原料药发酵冬虫夏草菌粉特异性引物扩增样品的凝胶电泳图；
[0017]
图2本发明的中国被毛孢菌、发酵冬虫夏草菌粉、百令胶囊/片及冬虫夏草药材的实时荧光pcr扩增曲线；
具体实施方式
[0018]
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0019]
在本实施例子中包括以下步骤：
[0020]
取代表性样品发酵冬虫夏草菌粉(hir.sin.)的its序列应用idtdna网站进行在线引物和探针的设计，并将设计的引物和探针与样本序列进行比对，去掉公共引物和探针，其余的引物和探针合成，进行筛选与优化。
[0021]
筛选、优化引物
[0022]
采用pcr凝胶电泳方法对设计的引物进行一一筛选与优化，结果优选出一对特异性较好的引物和探针序列。
[0023]
[鉴别]
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实时荧光pcr方法
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模板dna提取取本品(药材)适量，依次用75％乙醇1ml、灭菌超纯水1ml清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉(或直接取用粉末)。取粉末约20mg，置于2ml无菌离心管中，加入灭菌玻璃珠适量，于高速球磨仪上研磨，频率为30hz/次，1min/次，共6次，加入缓冲液ap1500μl，rna酶溶液4μl，涡旋振荡，按照植物基因组提取试剂盒方法提取dna，得到洗脱液150μl，作为供试品溶液，测定浓度和纯度，置4℃冰箱中待用。另取发酵冬虫夏草菌粉对照药材同法制成对照药材模板dna溶液，随行提取空白溶液。
[0026]
rt pcr反应特异性引物：5’caccacagcagttgcct 3’和5’tcatttgcttgcttcttgactg 3’。
[0027]
一种中国被毛孢菌的探针：5’cctgtcgcagtggcatctct 3’。
[0028]
pcr反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体系为25μl。
[0029]
反应体系包括10
×
buffer缓冲液2.5μl，dntp(10mmol/l)1.0μl，引物(50μmol/l)各0.2μl，探针0.2μl，taq dna聚合酶(5u/μl)0.15μl，模板2μl，无菌超纯水18.75μl。将离心管置实时荧光定量pcr仪，pcr反应参数：95℃预变性5分钟，循环反应40次(95℃30秒，60℃
30秒，72℃60秒)，得到扩增曲线。
[0030]
如图1百令胶囊的原料药发酵冬虫夏草菌粉特异性引物扩增样品的凝胶电泳图；图2本发明的中国被毛孢、发酵冬虫夏草菌粉、百令胶囊/片及冬虫夏草药材的实时荧光pcr扩增曲线。
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结果判断
[0032]
阳性样品在ct 20之前出峰，呈现阳性扩增曲线，对照药材也在ct 20之前出峰，空白溶液则不出峰。
[0033]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。