1.本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是一种提高核黄素产量的发酵方法。
背景技术：
2.核黄素(riboflavin)又称维生素b2(vitaminb2)，化学式为c
17
h
20
n4o6，微溶于水，在中性和酸性条件下稳定，易溶于碱，在碱性条件下见光发生不可逆的分解。核黄素是人体必需的13种维生素之一，是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质。由于动物和人类缺少内源性核黄素生成途径，故不能自身合成，需要从外界补充适量的核黄素，被称为世界卫生组织列为人体生长发育和营养状况的六大指标之一。在医疗方面，核黄素常被用作一种辅助药物用于多种疾病的治疗；在食品工业方面，通常作为色素和营养添加剂添加到食品中；在畜牧业方面，用作动物饲料添加剂，可避免禽畜生长滞后及腹泻等症状。
3.工业生产核黄素主要是化学合成法和微生物发酵法。化学合成法生产工艺成熟，但存在环境污染大、操作复杂等问题，故逐步被微生物发酵法所取代。但随着核黄素的需求量逐步扩大，发酵生产核黄素所面临的问题也逐渐变多。现阶段发酵生产核黄素发酵周期长，产量低，营养利用率低，造成了严重的资源浪费和成本提高。
技术实现要素：
4.本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高核黄素产量的发酵方法。
5.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
6.一种提高核黄素产量的发酵方法，将葡萄糖酸金属络合物添加至发酵培养基中，同时在发酵过程中当菌体量到达15
‑
20时，流加发酵营养物，直至发酵结束，其中，所述葡萄糖酸金属络合物由葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙组成，其含量为葡萄糖酸亚铁100mg/l，葡萄糖酸锌70mg/l，葡萄糖酸钙70mg/l；所述发酵营养物成分及含量为：柠檬酸3g/l、谷氨酰胺1g/l和kh2po43g/l。
7.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，所述发酵培养基体积为2l，葡萄糖酸金属络合物按照发酵培养基的体积确定添加量。
8.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，所述发酵营养物的流加用量为300ml，发酵期间使用蠕动泵流加，流加速度为0.2g/l/h。
9.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，具体步骤如下：
10.(1)菌种活化：将核黄素枯草芽孢生产菌从
‑
80℃冰箱取出，在斜面培养基上活化两代，所述斜面培养基成分及含量为：胰蛋白胨10g/l，牛心浸粉17.5g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖2g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，琼脂粉25g/l；
11.(2)种子培养：将活化后的菌种经无菌水洗脱，洗脱后接入种子培养基中进行培养，所述种子培养基的成分及含量为：葡萄糖80g/l，酵母粉8g/l，蛋白胨3g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，硫酸铵8g/l，feso4·
7h2o 10mg/l，mnso4·
h2o 5mg/l，v
h
1mg/l，消泡剂1g/l；
12.(3)发酵培养：将30％的种子液接种到添加有葡萄糖酸金属络合物的发酵培养基
中，连续培养，中间补料，得到发酵液，所述发酵培养基的成分及含量为：葡萄糖80g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨2g/l，磷酸氢二钾2g/l，磷酸二氢钾3g/l，七水合硫酸镁2g/l，硫酸铵10g/l，feso4·
7h2o 15mg/l，mnso4·
h2o 10mg/l，v
h
1mg/l，谷氨酸10g/l，葡萄糖酸亚铁100mg/l，葡萄糖酸锌70mg/l，葡萄糖酸钙70mg/l，消泡剂1g/l；
13.(4)营养物流加：当菌体量达到15
‑
20时，开始流加发酵营养物(流加用量300ml，发酵期间使用蠕动泵匀速流加，流加速度0.2g/l/h)，其成养基中，同时在发酵过程中当菌体量到达15
‑
20时，流加发酵营养物，直至发酵结束，其中，所述葡萄糖酸金属络合物由葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙组成，其含量为葡萄糖酸亚铁100mg/l，葡萄糖酸锌70mg/l，葡萄糖酸钙70mg/l；所述发酵营养物成分及含量为：柠檬酸3g/l、谷氨酰胺1g/l和kh2po43g/l。
14.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，所述发酵培养基体积为2l，葡萄糖酸金属络合物按照发酵培养基的体积确定添加量。
15.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，所述发酵营养物的流加用量为300ml，发酵期间使用蠕动泵流加，流加速度为0.2g/l/h。
16.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，具体步骤如下：
17.(1)菌种活化：将核黄素枯草芽孢生产菌从
‑
80℃冰箱取出，在斜面培养基上活化两代，所述斜面培养基成分及含量为：胰蛋白胨10g/l，牛心浸粉17.5g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖2g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，琼脂粉25g/l；
18.(2)种子培养：将活化后的菌种经无菌水洗脱，洗脱后接入种子培养基中进行培养，所述种子培养基的成分及含量为：葡萄糖80g/l，酵母粉8g/l，蛋白胨3g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，硫酸铵8g/l，feso4·
7h2o 10mg/l，mnso4·
h2o 5mg/l，v
h
1mg/l，消泡剂1g/l；
19.(3)发酵培养：将30％的种子液接种到添加有葡萄糖酸金属络合物的发酵培养基中，连续培养，中间补料，得到发酵液，所述发酵培养基的成分及含量为：葡萄糖80g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨2g/l，磷酸氢二钾2g/l，磷酸二氢钾3g/l，七水合硫酸镁2g/l，硫酸铵10g/l，feso4·
7h2o 15mg/l，mnso4·
h2o 10mg/l，v
h
1mg/l，谷氨酸10g/l，葡萄糖酸亚铁100mg/l，葡萄糖酸锌70mg/l，葡萄糖酸钙70mg/l，消泡剂1g/l；
20.(4)营养物流加：当菌体量达到15
‑
20时，开始流加发酵营养物(流加用量300ml，发酵期间使用蠕动泵匀速流加，流加速度0.2g/l/h)，其成分及含量为：柠檬酸3g/l、谷氨酰胺1g/l和kh2po43g/l。
21.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，发酵过程中当菌体量达到80时，开始进行流加发酵营养物(流加用量300ml，发酵期间使用蠕动泵匀速流加，流加速度0.2g/l/h)。
22.优选的，上述提高核黄素产量的发酵方法，基础培养条件为：发酵体积2l，发酵温度34℃，ph 7.0
‑
7.2，溶氧40％
‑
50％，发酵时间50h。
23.有益效果：
24.上述提高核黄素产量的发酵方法，通过将葡萄糖酸金属络合物添加到发酵培养基中以及流加发酵营养物，能够使糖类物质的功能多元化，优化菌体对金属元素的吸收，降低金属元素对菌体的毒副作用；随者发酵的进行，发酵罐中的营养成分逐渐下降，菌体的活力逐渐变弱，流加发酵营养物可以补充发酵过程中菌体所需的营养成分，保持菌体的生长活力；柠檬酸的添加，抑制了emp途径，加强了hmp途径；谷氨酰胺加强了核黄素前体物三磷酸
鸟苷(gtp)的生成，有利于核黄素的积累；枯草芽孢杆菌生产核黄素作为生长偶联型菌株，菌体量的多少在很大程度上影响了核黄素的产量，流加kh2po4可以使菌体保持良好的生长态势，进而增加核黄素的产量。
具体实施方式
25.实施例1
26.一种提高核黄素产量的发酵方法，具体步骤如下：
27.(1)菌种活化：将核黄素枯草芽孢生产菌从
‑
80℃冰箱取出，在斜面培养基上活化两代。斜面培养基成分及含量为：胰蛋白胨10g/l，牛心浸粉17.5g/l，氯化钠5g/l，葡萄糖2g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，琼脂粉25g/l，ph＝7.0。
28.(2)种子培养：将活化后的菌种经无菌水洗脱，洗脱后接入种子培养基中进行培养。种子培养基的成分及含量为：葡萄80g/l，酵母粉8g/l，蛋白胨3g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，硫酸铵8g/l，feso4·
7h2o 10mg/l，mnso4·
h2o 5mg/l，v
h
1mg/l，消泡剂1g/l，用氨水调节培养基ph在7.0
‑
7.2。
29.(3)发酵培养：将30％的种子液接种到2l发酵培养基中，连续培养，中间补料，得到发酵液。发酵培养基为：葡萄糖80g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨2g/l，磷酸氢二钾2g/l，磷酸二氢钾3g/l，七水合硫酸镁2g/l，硫酸铵10g/l，feso4·
7h2o 15mg/l，mnso4·
h2o 10mg/l，v
h
1mg/l，谷氨酸10g/l，消泡剂1g/l，用氨水调节培养基ph在7.0
‑
7.2，发酵温度34℃，溶氧40％
‑
50％，发酵时间50h。50h放罐时，核黄素产量为23.2g/l。
30.实施例2
31.一种提高核黄素产量的发酵方法，参照实施例1，不同之处在于：不流加发酵营养物，同时在发酵培养基中加入葡萄糖酸金属络合物(发酵培养基体积为2l，葡萄糖酸金属络合物按照发酵培养基的体积确定添加量)，其成分与含量为：葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸钙组成，其含量为：100mg/l，70mg/l，70mg/l。50h放罐时，核黄素产量为26.7g/l。
32.实施例3
33.一种提高核黄素产量的发酵方法，参照实施例1，不同之处在于:当菌体量达到15时，开始流加发酵营养物(流加用量300ml，发酵期间使用蠕动泵匀速流加，流加速度0.2g/l/h)，不在发酵培养基中添加葡萄糖酸金属络合物。发酵营养物成分及含量为：柠檬酸3g/l、谷氨酰胺1g/l和kh2po43g/l。50h放罐时，核黄素产量为27.3g/l。
34.实施例4
35.一种提高核黄素产量的发酵方法，参照实施例1
‑
3，当菌体量达到15时，开始流加发酵营养物，其成分及含量为：柠檬酸3g/l、谷氨酰胺1g/l和kh2po43g/l。同时在发酵培养基中添加葡萄糖酸金属络合物，其成分及含量为：葡萄糖酸亚铁100mg/l、葡萄糖酸锌70mg/l、葡萄糖酸钙70mg/l；流加发酵营养物成分及含量为：柠檬酸3g/l、谷氨酰胺1g/l和kh2po43g/l。50h放罐时，核黄素产量为32.6g/l。
36.结果表明，采用本发明所述方法可有效的提高菌体对金属离子的吸收，保证菌体在发酵过程中的活力，提高核黄素的产量，同时缩短了发酵周期，节约了成本，提升了经济效益。
37.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。