分选柱的制备方法及分选柱与流程

1.本发明涉及细胞分选技术领域，尤其涉及一种分选柱的制备方法及分选柱。


背景技术：

2.细胞分选技术在临床诊断、细胞免疫治疗、癌症治疗等方面有着重要的作用。近年来，在癌症治疗方面，一种被称为car
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t疗法（嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，chimeric antigen receptor t
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cell immunotherapy）的方法被广泛研究，在临床肿瘤治疗上取得了很好的效果。在car
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t治疗血癌的过程中有一个非常重要的步骤是t细胞分选，即通过外周血血细胞分离机从肿瘤病人的血液中分离出单个核细胞，然后采用细胞分选技术磁珠纯化t细胞。
3.当前，常用的细胞分选技术分为两大类。第一类是大磁珠吸附和分选，使用的大磁珠的直径较大，一般为微米级别。分选过程是大磁珠吸附在目标细胞表面，外加磁场作用在容纳有多种细胞的溶液的普通试管，吸引表面附着了大磁珠的目标细胞。但是这种分选方法的分选纯度较低，一般在90%左右。而且大磁珠的磁力较大，有可能对目标细胞表面的活性位点造成不可逆的损伤；分选后需要进行洗脱操作。第二类是小磁珠吸附和分选，使用的小磁珠的直径较小，一般小于100纳米，具有顺磁性的特点，是一种超顺纳米磁珠。分选过程是小磁珠吸附在目标细胞表面，使包含了多种细胞的溶液通过分选柱，同时外加磁场作用于分选柱，吸引表面附着了小磁珠的目标细胞。这种分选方法的分选纯度较高，可以达到95%以上。而且小磁珠的磁力较小，对目标细胞表面的活性位点影响较小；分选后不需要进行洗脱操作，有利于后续实验或治疗的进行。
4.小磁珠吸附和分选的细胞分选技术必须使用分选柱进行磁力吸引，而分选柱的制备流程非常复杂、价格较高，导致细胞分选的成本非常高。这些因素直接制约了小磁珠吸附和分选的细胞分选技术的大范围推广。


技术实现要素：

5.本发明实施例提供一种分选柱的制备方法，旨在解决现有技术中分选柱的制备流程复杂、成本高的问题。
6.第一方面，提供了一种分选柱的制备方法，包括：通过聚合物材料粘合铁砂以及将铁砂粘合在分选柱本体内；在第一预设条件下对粘合了铁砂的分选柱本体进行离心；在第二预设条件下对经离心后的分选柱本体进行烘烤；其中，所述聚合物材料由单体聚合而成或者为高分子聚合物，所述单体为丙烯酸单体或者苯乙烯单体，所述高分子聚合物为丙烯酸树脂类、聚氨酯类、环氧类或者硅胶类的高分子聚合物；所述第一预设条件为：离心力等于1000乘以重力加速度，离心时间为1分钟
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10分钟；所述第二预设条件为：烘烤温度等于100摄氏度，烘烤时间为3小时
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10小时。
7.第二方面，提供了一种分选柱，由上述的方法制备得到。
8.本发明实施例通过聚合物材料粘合铁砂以及将铁砂粘合在分选柱本体内，然后依次在第一预设条件下对分选柱本体进行离心，在第二预设条件下对分选柱本体进行烘烤，采用常见的聚合物材料和通过特定的制备工艺得到符合小磁珠吸附和分选的细胞分选技术需使用的分选柱，制备工艺简单、成本较低。
附图说明
9.本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是小磁珠吸附和分选的细胞分选技术的示意图；图2是本发明实施例一提供的分选柱的示意图；图3是本发明实施例二提供的分选柱的制备方法的流程图；图4是本发明实施例二提供的图3中步骤s302的流程图；图5是本发明实施例二提供的图3中步骤s302的另一流程图。
具体实施方式
10.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的模块或具有相同或类似功能的模块。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。相反，本发明的实施例包括落入所附加权利要求书的精神和内涵范围内的所有变化、修改和等同物。
11.小磁珠吸附和分选的细胞分选技术中所使用的小磁珠，直径较小，一般小于100纳米。具有顺磁性的特点，在外加磁场下被磁化，外加磁场被撤掉后磁性会马上消失，是一种超顺纳米磁珠。
12.图1是小磁珠吸附和分选的细胞分选技术的示意图。分选过程为：分选柱和外加磁场配合使用，使外加磁场作用于分选柱填充了铁砂的区域。在外加磁场的作用下，铁砂内形成感应磁场。外加磁场和感应磁场相互叠加，在分选柱填充了铁砂的区域形成相当于几百倍甚至上千倍于外加磁场的叠加磁场，由此，纳米级别的小磁珠也可被吸引。将包含了多种细胞的溶液（其中含有表面吸附了小磁珠的目标细胞）通过分选柱，目标细胞经过分选柱填充了铁砂的区域时在叠加磁场的作用下迅速移动、聚集，实现细胞分选。
13.实施例一图2是本发明实施例一提供的分选柱的示意图。如图2所示，分选柱包括分选柱本体和铁砂。在本发明实施例中，细胞分选时，分选柱本体作为容器使用，需要具备一定程度的刚性，至少满足在5千克外加压力下不变形。此外，分选柱本体采用医用的ps（聚苯乙烯，polystyrene）、pp（聚丙烯，plyprpylene）、pc（聚碳酸酯，polycarbonate）、pvc（聚氯乙烯，polyvinyl chloride）等塑料制成，满足对细胞无毒无害的要求。在分选柱本体的一定区域内填充铁砂，铁砂的直径控制在50um
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500um之间。分选柱本体包括第一部分、第二部分和尖端。这三个部分均近似为圆柱状，依次首尾相接、贯通，直径依次减小。即第二部分位于第一部分和尖端之间，第二部分的直径介于第一部分的直径和尖端的直径之间。在第二部分内填充铁砂，对第二部分引入外加磁场时，在第二部分内会产生叠加磁场。
14.细胞分选时，包含了多种细胞的溶液（其中含有表面吸附了小磁珠的目标细胞）从第一部分的入口进入分选柱。进入第二部分时遇到铁砂，而且第二部分的直径小于第一部分的直径，溶液流速变慢，此时第一部分相当于容器，可容纳一部分溶液。溶液进入第二部分后受到叠加磁场的作用，表面吸附了小磁珠的目标细胞定向移动，聚集到铁砂上，其他成分从铁砂的间隙流过然后从尖端流出。尖端的直径小于第二部分的直径，可进一步降低溶液的流速，延长溶液流经铁砂的时间，使得叠加磁场对目标细胞的影响更为充分。
15.为了防止铁砂在制备分选柱的过程中流出，在填充铁砂之前将圆球放入分选柱内。在本发明实施例中，圆球的直径介于第二部分的直径和尖端的直径之间，堵塞从第二部分到尖端的通道。圆球的材质包括但不限于金属、陶瓷和玻璃等。
16.填充在第二部分的铁砂，铁砂和铁砂之间、铁砂和第二部分之间的粘合程度是决定分选柱是否符合细胞分选要求的关键。本发明实施例的分选柱由如下实施例的制备方法制备得到，在此不展开详述。
17.实施例二图3是本发明实施例二提供的分选柱的制备方法的流程图。在本发明实施例中，分选柱的结构与实施例一相同，与实施例一相同的各部件沿用与实施例一相同的名称，包括在实施例一中描述的全部特征，在此不再赘述。如图3所示，该方法包括：步骤s301：将圆球放入分选柱本体，圆球的直径介于第二部分的直径和尖端的直径之间。
18.步骤s302：通过聚合物材料粘合铁砂以及将铁砂粘合在分选柱本体内。
19.在本发明实施例中，铁砂和铁砂之间、铁砂和分选柱本体的第二部分之间通过聚合物材料连接。聚合物材料由单体聚合而成或者为高分子聚合物。单体包括但不限于丙烯酸单体或者苯乙烯单体。高分子聚合物包括但不限于丙烯酸树脂类、聚氨酯类、环氧类或者硅胶类的高分子聚合物。
20.除了连接铁砂、连接铁砂和第二部分外，聚合物材料包裹着铁砂，可防止水分和氧气对铁砂的腐蚀；并且在细胞分选时，防止铁砂和细胞直接接触，避免铁砂中有害离子释放对细胞造成损害。
21.为了缩短铁砂的润湿时间，可在聚合物材料中加入含有较多亲水基团的亲水性物质，使得聚合物材料包括亲水基团。亲水基团如
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cooh、
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oh和
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nh2，亲水性物质包括但不限于聚乙烯醇、聚马来酸酐、聚乙烯吡咯烷酮、聚季胺盐或者聚乙二醇等。经过后续步骤制备得到的分选柱，加入超纯水或pbs溶液（磷酸盐缓冲盐溶液，phosphate buffered saline）后，铁砂的润湿性（润湿时间）良好。
22.作为本发明的一个实施例，通过聚合物材料粘合铁砂以及将铁砂粘合在分选柱本体内，如图4所示，该方法包括：步骤s401：在分选柱本体的第二部分填充铁砂。
23.步骤s402：向铁砂添加具有流动性的聚合物材料。
24.在本发明实施例中，采用特定的定量填充装置在分选柱的第二部分填充铁砂，然后加入还未凝固的聚合物材料，即具有流动性聚合物材料，聚合物材料慢慢包裹着铁砂颗粒，最后进入后续的离心和烘烤步骤。
25.作为本发明的另一个实施例，通过聚合物材料粘合铁砂以及将铁砂粘合在分选柱
本体内，如图5所示，该方法包括：步骤s501：在容器中将铁砂和聚合物材料搅拌均匀。
26.步骤s502：在分选柱本体的第二部分填充搅拌均匀的具有流动性的铁砂和聚合物材料。
27.在本发明实施例中，首先将铁砂和还未凝固的聚合物材料在一容器中充分搅拌均匀，然后采用特定的定量填充装置在分选柱的第二部分填充还未凝固的铁砂和聚合物材料的混合物，最后进入后续的离心和烘烤步骤。将铁砂和聚合物材料先搅拌均匀再填充使得聚合物材料包裹铁砂颗粒更充分更均匀。
28.步骤s303：在第一预设条件下对粘合了铁砂的分选柱本体进行离心。
29.在本发明实施例中，在第一预设条件（离心力等于1000乘以重力加速度，离心时间为1分钟
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10分钟）下对粘合了铁砂的分选柱本体进行离心。此时，铁砂和聚合物材料的混合物还处于未凝固的状态，在1000g离心力下，对粘合了铁砂的分选柱本体离心1min
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10min，将多余的聚合物材料去除，更好地均匀聚合物材料在铁砂之间的分布和铁砂在第二部分内的分布。第一预设条件及后续烘烤的第二预设条件共同决定了铁砂和铁砂之间、铁砂和第二部分之间的粘合程度，进而影响分选柱的润湿时间、细胞得率、细胞纯度等性能指标。
30.步骤s304：在第二预设条件下对经离心后的分选柱本体进行烘烤。
31.烘烤温度和烘烤时间最终决定铁砂和铁砂之间、铁砂和第二部分之间的粘合程度。在本发明实施例中，在第二预设条件（烘烤温度等于100摄氏度，烘烤时间为3小时
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10小时）下对经离心后的分选柱本体进行烘烤。烘烤后铁砂和铁砂之间、铁砂和第二部分之间具有良好的结合力。
32.本发明实施例通过聚合物材料粘合铁砂以及将铁砂粘合在分选柱本体内，然后依次在第一预设条件下对分选柱本体进行离心，在第二预设条件下对分选柱本体进行烘烤，采用常见的聚合物材料和通过特定的制备工艺得到符合小磁珠吸附和分选的细胞分选技术需使用的分选柱，制备工艺简单、成本较低。
33.采用上述制备方法制备得到的分选柱与现有的分选柱在相同的实验条件下进行对比测试。分选的目的细胞为小鼠脾脏cd3细胞，对比润湿时间、单滴液体滴落间隔时间、细胞得率和阳性分选管cd3细胞纯度四个性能指标。
34.单细胞悬液制备流程如下。
35.（1）将小鼠脾脏组织转移到细胞滤网上，用无菌注射器活塞扁平端轻轻研磨组织，边研磨边加入缓冲液，去除结缔组织及脂肪，收集研磨得到的单细胞悬液，在500g离心力、4摄氏度下离心5min后弃上清。
36.（2）加入5ml红细胞裂解液，混匀，4摄氏度下裂红3min
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5min。
37.（3）加入5倍体积的缓冲液，70um滤膜过滤（提前用2ml缓冲液润湿），过滤后在500g离心力、4摄氏度下离心5min后弃上清；再加5ml缓冲液重悬后离心，弃上清。
38.（4）用1.8 ml缓冲液重悬细胞，放置于4摄氏度下并计数，得到单细胞悬液。
39.细胞标记过程如下。
40.（1）从单细胞悬液取一部分，调整细胞浓度至108个/ml。
41.（2）用100ul缓冲液重悬107个细胞于2ml离心管中。
42.（3）加10ul生物素标记的抗体（每107个细胞），充分混匀并在冰箱孵育10min。
43.（4）加1ml缓冲液，在500g离心力下离心5min，去上清。
44.（5）加80ul缓冲液重悬细胞。
45.（6）加20ul抗生物素蛋白小磁珠，充分混匀并在冰箱（2摄氏度
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摄氏度）孵育15分钟。
46.（7）每107个细胞加1ml缓冲液，在500g离心力下离心5min，去上清。
47.（8）加2ml缓冲液重悬细胞，进行细胞计数，然后可开始细胞分选。
48.细胞分选过程如下。
49.（1）将分选柱放在外加磁场中，用2ml缓冲液洗涤分选柱。
50.（2）将细胞标记过程（8）所得的单细胞悬液加入到分选柱，收集通过分选柱的滤液。
51.（3）用2*2ml缓冲液洗涤分选柱，收集滤液，该滤液含没有标记的细胞，即非目标细胞，得到阴性分选管。
52.（4）从外加磁场中取出分选柱，加入2ml缓冲液，推动针管式活塞冲洗分选柱，得到阳性标记细胞。此时收集的溶液含目标细胞，得到阳性分选管。
53.（5）使用细胞计数仪计算阴性分选管和阳性分选管的细胞数。
54.（6）使用流式细胞计数仪检测阳性分选管中cd3细胞纯度。
55.得到四个性能指标的对比测试结果如下表。从表中可以看出，本发明分选柱在润湿时间、单滴液体滴落间隔时间、细胞得率和阳性分选管cd3细胞纯度这四个性能指标上与现有的分选柱接近，已经达到现有分选柱的效果，符合小磁珠吸附和分选的细胞分选技术的要求。
56.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。