肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法与流程

1.本技术涉及肺腺癌诊断检测领域，更具体地说，尤其涉及一种肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法。


背景技术：

2.根据美国癌症学会官方期刊《临床医师癌症杂志》发布的“2018年全球癌症统计数据”报告，肺癌依旧是全球发病率(11.6％)和死亡率(18.4％)第一位的恶性肿瘤。目前，每年通过胸片或者ct检查发现肺部有结节的人群逐渐增多。
3.肺结节是肺内占位性病变。根据其直径大小来定义，肺内直径≤3cm的类圆形或不规则形病灶，可单发或者多发，称之为肺结节。肺结节直径在0.5cm
‑
1cm属于肺小结节，直径＞3cm则称为肿块。根据ct影像学表现，肺结节可以分为纯磨玻璃结节、混合磨玻璃结节和实性结节。纯磨玻璃结节就像磨砂玻璃一样，呈现出云絮状的阴影；实性结节则是肺内密度比较高的阴影；混合磨玻璃结节，既包含实性成分，也包含磨玻璃成分，通常实性成分在磨玻璃成分中间。胸膜凹陷征、引流线征、血管集束征、毛刺征、棘突征、分叶征、空泡和细支气管充气征等ct影像改变，都是肺结节恶变的征象。其中，恶变概率的排列顺序应该是：混合磨玻璃结节＞磨玻璃结节＞实性结节。
4.国际肺癌研究协会(iaslc)提倡使用液体活检来诊断非小细胞肺癌(nsclc)。血浆游离肿瘤dna(ctdna)甲基化液体活检最大的优势就是可以在超早期通过常规手段无法检测到的情况下检测出是否有细胞癌变的可能。dna甲基化具有细胞组织特异性的特点，具有极高的特异性，适合用于疾病的早期诊断。
5.目前，肺癌ctdna甲基化的检测手段多为ngs，该方法耗时长，费用较高，需要专业人员进行生信分析，因此，不利于在基层医院临床推广。
6.因此，怎样提高肺癌ctdna甲基化的检测效率，已成为本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本技术提供了一种肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法，能提高肺癌ctdna甲基化的检测效率。
8.本技术提供的技术方案如下：
9.本技术提供一种基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的引物，包括：内参引物与检测引物，所述检测引物用于检测肺腺癌特异性dna甲基化标志物，所述肺癌特异性dna甲基化标志物包括：alx3基因、hoxc13基因。
10.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述检测引物用于扩增所述肺癌特异性dna甲基化标志物的一段序列。
11.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述alx3基因的引物序列如下：
12.引物1a：ggcgtagttgcgcgtttattc；aaacccgccttatttcccg
13.探针1a：tggattggaaacgtttcgagtcggttattt
14.引物1b：cgaagagggaattcgttttatttttc；caactacgcgctcactcg
15.探针1b：ttaaaataatcggttcggagcgtttttagt。
16.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述hoxc13基因的引物序列如下：
17.引物2a：gatttgggggattcgagttgc；gaacgaacgataactaaaaaacgcg
18.探针2a：caactaaacccgctcgtttcccgcca
19.引物2b：gtggttaggggacgc；aaaatctaaaaaacccgaactacg
20.探针2b：tagttgagttcgttcgtttttcgttattgt。
21.进一步地，在本发明一种优选的方式中，还提供一种基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的试剂盒，包括：所述的基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的引物，洗涤液，纯化液，dna提取液，阳性对照与阴性对照。
22.优选地，所述洗涤剂为纯化水。
23.优选地，所述纯化液为异丙醇或乙醇。
24.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述试剂盒为荧光pcr试剂盒，所述试剂盒用于检测肺癌特异性dna甲基化位点。
25.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述转化液为亚硫酸盐溶液。
26.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述试剂盒通过检测血浆及其他体液中的肺癌特异dna甲基化区域，结合内参表达情况，用于早期诊断、筛查和治疗后微小病灶的检测。
27.进一步地，在本发明一种优选的方式中，还提供一种检测肺腺癌特异dna甲基化区域的方法，包括以下步骤：
28.s1，提取血液样品，分离血浆；
29.s2，提取ctdna样品；
30.s3，对ctdna样品进行亚硫酸盐转化处理；
31.s4，进行甲基化特异性pcr：使用所述的肺腺癌诊断检测的试剂盒实时荧光甲基化特异性pcr扩增转化后的ctdna，以检测alx3基因或hoxc13基因甲基化区域；
32.s5，对检测的甲基化区域结果进行比对。
33.进一步地，在本发明一种优选的方式中，所述方法用于区分肿瘤和正常组织。
34.本发明所提供的技术方案，与现有技术相比，通过检测两个肺癌ctdna甲基化位点，可以有效判断早期肺癌的发生情况，技术简单，可在基层医院开展，相较ngs，大幅减低了检测成本，提高了检测效率。
附图说明
35.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1为本发明实施例提供的基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的试剂盒检测的alx3基因或hoxc13基因的甲基化区域比较图；
37.图2为本发明实施例提供的检测肺腺癌特异dna甲基化区域方法的步骤流程图。
具体实施方式
38.为了使本领域的技术人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合申请实施例中的附图对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
39.需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件上，它可以直接在另一个元件上或者间接设置在另一个元件上；当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至另一个元件上。
40.需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、下”、“前”、“后”、“第一”、“第二”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。
41.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本技术的描述中，“多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
42.须知，本说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配说明所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本技术所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
43.请如图1
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图2所示，本技术提供一种基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的引物，包括：内参引物与检测引物，所述检测引物用于检测肺腺癌特异性dna甲基化标志物，所述肺癌特异性dna甲基化标志物包括：alx3基因、hoxc13基因。
44.本发明提供的肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法，与现有技术相比，本发明涉及的基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的引物，包括：内参引物与检测引物，所述检测引物用于检测肺腺癌特异性dna甲基化标志物，所述肺癌特异性dna甲基化标志物包括：alx3基因、hoxc13基因，本发明涉及的基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的试剂盒，包括：基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的引物，洗涤液，纯化液，dna提取液，阳性对照与阴性对照，本发明涉及的检测肺腺癌特异dna甲基化区域的方法，包括以下步骤：s1，提取血液样品，分离血浆；s2，提取ctdna样品；s3，对ctdna样品进行亚硫酸盐转化处理；s4，使用所述的肺腺癌诊断检测的试剂盒实时荧光甲基化特异性pcr扩增转化后的ctdna，以检测alx3基因或hoxc13基因甲基化区域，如此，通过检测两个肺癌ctdna甲基化位点，可以有效判断早期肺癌的发生情况，技术简单，可在基层医院开展，相较ngs，大幅减低了检测成本，提高了检测效率。
45.具体地，在本发明实施例中，提供一种基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的引物，包括：内参引物与检测引物，所述检测引物用于检测肺腺癌特异性dna甲基化标志物，所述
肺癌特异性dna甲基化标志物包括：alx3基因、hoxc13基因。
46.具体地，在本发明实施例中，所述检测引物用于扩增所述肺癌特异性dna甲基化标志物的一段序列。
47.具体地，在本发明实施例中，所述alx3基因的引物序列如下：
48.引物1a：ggcgtagttgcgcgtttattc；aaacccgccttatttcccg
49.探针1a：tggattggaaacgtttcgagtcggttattt
50.引物1b：cgaagagggaattcgttttatttttc；caactacgcgctcactcg
51.探针1b：ttaaaataatcggttcggagcgtttttagt。
52.具体地，在本发明实施例中，所述hoxc13基因的引物序列如下：
53.引物2a：gatttgggggattcgagttgc；gaacgaacgataactaaaaaacgcg
54.探针2a：caactaaacccgctcgtttcccgcca
55.引物2b：gtggttaggggacgc；aaaatctaaaaaacccgaactacg
56.探针2b：tagttgagttcgttcgtttttcgttattgt。
57.具体地，在本发明实施例中，还提供一种基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的试剂盒，包括：所述的基于血浆ctdna的肺腺癌诊断检测的引物，洗涤液，纯化液，dna提取液，阳性对照与阴性对照。
58.需要补充说明的是，在本发明实施例中，所述阳性对照液为100％甲基化对照液，所述阴性对照液体为0％甲基化对照液。
59.具体地，在本发明实施例中，所述试剂盒为荧光pcr试剂盒，所述试剂盒用于检测肺癌特异性dna甲基化位点。
60.具体地，在本发明实施例中，所述转化液为亚硫酸盐溶液。
61.具体地，在本发明实施例中，所述试剂盒通过检测血浆及其他体液中的肺癌特异dna甲基化区域，结合内参表达情况，用于早期诊断、筛查和治疗后微小病灶的检测。
62.需要补充说明的是，在本发明实施例中，所述试剂盒通过荧光探针pcr法检测两个肺癌特异性dna甲基化区域，两个肺腺癌特异性dna甲基化标志物为alx3和hoxc13基因，alx3和hoxc13基因两个基因之一或全部均可作为检测靶点。
63.更为具体地阐述，所述试剂盒通过荧光探针pcr法检测alx3基因的引物序列或其变体、hoxc13基因的引物序列或其变体。
64.需要补充说明的是，在本发明实施例中，所述试剂盒通过荧光探针pcr法检测两个肺癌特异性dna甲基化区域时，还需进行一个输入样本的内参检测。
65.具体地，在本发明实施例中，还提供一种检测肺腺癌特异dna甲基化区域的方法，包括以下步骤：
66.s1，提取血液样品，分离血浆；
67.s2，提取ctdna样品；
68.s3，对ctdna样品进行亚硫酸盐转化处理；
69.s4，进行甲基化特异性pcr：使用所述的肺腺癌诊断检测的试剂盒实时荧光甲基化特异性pcr扩增转化后的ctdna，以检测alx3基因或hoxc13基因甲基化区域；
70.s5，对检测的甲基化区域结果进行比对。
71.具体地，在本发明实施例中，所述方法用于区分肿瘤和正常组织。
72.需要补充说明的是，在本发明实施例中，血细胞并不会影响结果判断。
73.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。