一种具有降糖能力的格氏乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及格氏乳杆菌菌株ckcc 1913及其应用。


背景技术：

2.血糖主要指血液中的葡萄糖。高血糖为在空腹或餐后2h血糖水平超过正常值的一种状态。慢性高血糖发展至一定程度会演变为糖尿病。中国已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家，糖尿病患者超过1亿。因此，需要通过有效的措施来预防和治疗糖尿病。二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase iv，dpp-iv)抑制剂是最新和最有前途的抗糖尿病药物。2009年，中国食品药品监督管理局批准首个dpp-iv抑制剂，即西他列汀在中国上市。这些dpp-iv抑制剂类口服药物主要通过延长促胰岛素多肽(gip)和胰高血糖素样肽-1(glp-1)的肠促胰岛素作用，在血糖管理中发挥有益作用。dpp-iv是一种非常稳定的、在肠道中高表达的细胞表面丝氨酸蛋白酶，可以将多肽n端第2位的脯氨酸(pro)或丙氨酸 (ala)残基水解而使该活性多肽失活。人体中gip和glp-1均为dpp-iv的主要作用底物。目前研究发现，glp-1具有葡萄糖依赖性的刺激胰岛素的合成和分泌、抑制β细胞凋亡、抑制胰高糖素分泌、延缓胃排空等生理作用。因此，抑制 dpp-iv的活性，可增加glp和glp-1半衰期，促进胰岛素分泌，达到稳定血糖的目的。另外，控制餐后血糖对于预防和治疗早期糖尿病也具有重要意义。α
‑ꢀ
葡萄糖苷酶是存在于小肠黏膜刷状缘的一种水解酶，专门负责催化碳水化合物 (低聚糖、二糖等)水解消化过程，抑制α-葡萄糖苷酶活性已被证明可以降低葡萄糖吸收和缓解餐后血糖水平。因此α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种治疗方法，而阿卡波糖已经作为一种有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂用于糖尿病患者。有研究指出糖尿病发病机制中机体的氧化损伤与抗氧化能力的减弱是重要的发病机制之一，因此具备dpp
‑ⅳ
和α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株同时具备一定的抗氧化能力，可能会增强其改善血糖的效果。
3.益生菌是一类活性微生物，当以一定的量摄入会对宿主产生健康益处。乳酸菌作为一种食品安全级(gras)的微生物广泛应用于酸奶、奶酪和泡菜等食品的生产中。在众多的益生菌中，乳酸菌是食品中常用的菌株，具有刺激免疫系统、抑制病原菌附着、减少致病微生物的毒性作用、增强肠道屏障等作用。大量研究表明乳酸菌在生物医学防治中具有潜在的应用前景。如治疗乳糖不耐症、预防结肠癌、降低胆固醇、改善抗生素相关腹泻、减少炎症、缓解肠易激综合征、降低某些癌症的风险等多种保健作用。近年来，大量研究报道乳酸菌对预防和治疗糖尿病具有积极影响，可以不同程度的预防和缓解不同类型的糖尿病的发生。乳酸菌作用温和、性质稳定、效果明显而持久，因此开发具有降血糖作用的乳酸菌具有重要意义和应用前景，但目前国内对于乳酸菌作为糖尿病防治剂的研究较少。
4.中国发明专利，公开号为cn202011493493.9，公开了格氏乳杆菌ccfm1133 能够降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平、血清及肝脏的黄嘌呤氧化酶(xod) 活性，减少高尿酸血症和痛风的发生；并能够调节高尿酸血症患者的血糖、血清甘油三酯水平，提高肝脏过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力；提高回肠 abcg2的表达，促进肠道尿酸的排泄；以及提高肠道短链脂肪酸水平，促进健康。但该菌株不具备抑制二肽基肽酶-4和α-葡萄糖苷酶的
作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株新的格氏乳杆菌菌株ckcc 1913，该菌株的菌悬液、细胞代谢物及细胞内容物显著抑制二肽基肽酶-4和α-葡萄糖苷酶的活性，因此可以用于制备降低血糖、防治糖尿病的食品或药物。该菌株耐酸、耐碱，具有一定的粘附能力和抗氧化能力。
6.本发明的目的是提供一株格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)菌株ckcc1913。
7.本发明的另一目的是提供格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备食品方面的应用。
8.本发明的另一目的是提供格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备降血糖药物方面的应用。
9.本发明的另一目的是提供格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备防治糖尿病药物方面的应用。
10.本发明的另一目的是提供在制备二肽基肽酶-4抑制剂或α-葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。
11.本发明的另一目的是提供在制备抗氧化产品方面的应用。
12.本发明的另一目的是提供一种降血糖和/或防治糖尿病药物。
13.本发明的另一目的是提供一种发酵乳的制备方法。
14.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
15.申请人团队从新疆牧民自制发酵羊乳样本中经人工分离纯化获得了一株耐酸、耐碱，具有粘附能力和抗氧化能力，且能抑制二肽基肽酶-4和α-葡萄糖苷酶活性的菌株。该菌株经鉴定为格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)，命名为格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)ckcc 1913。于2021年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏号为cgmcc no. 23175。
16.菌株ckcc 1913形态特征如下：在mrs培养基上的菌落呈现白色、表面不光滑、干扁圆形。革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性。
17.研究显示，该格氏乳杆菌ckcc 1913能显著抑制二肽基肽酶-4和α-葡萄糖苷酶活性。因此本发明要求保护：
18.格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备食品方面的应用。
19.其中，具体地，所述食品是指发酵食品，包括发酵液、发酵乳、发酵果蔬、发酵果冻、发酵茶饮料、发酵面包、酸奶、干酪、酒酿、泡菜、酱油、食醋、豆豉、黄酒、啤酒、葡萄酒等等。
20.格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备降血糖药物方面的应用。
21.格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备防治糖尿病药物方面的应用。
22.格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备二肽基肽酶-4抑制剂或α-葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。
23.格氏乳杆菌菌株ckcc 1913在制备抗氧化产品方面的应用。
24.一种降血糖和/或防治糖尿病药物，含有上述格氏乳杆菌菌株ckcc 1913和 /或含有菌株ckcc 1913的细胞代谢物和/或菌株ckcc 1913的细胞内容物。
25.一种发酵乳的制备方法，是将格氏乳杆菌菌株ckcc 1913接种于原料乳中进行发酵培养。优选培养至ph值4.0～5.0。
26.更优选地，所述培养的条件为37
±
2℃培养20～28小时后，转接于新的原料乳中再次相同条件下发酵培养。
27.另外，上述原料乳可以是脱脂乳、生乳、乳粉等。
28.更优选地，该发酵乳的制备方法，包括如下步骤：
29.(1)将格氏乳杆菌菌株ckcc 1913接种于10％(m/v)的脱脂乳中，37
±
2℃培养20-28小时；
30.(2)将(1)中培养产物转接于新的10％(m/v)的脱脂乳中，37
±
2℃培养；
31.(3)当脱脂乳的ph值降至4.5
±
0.5时终止发酵，机械破乳即得发酵乳。
32.其中，优选地，步骤(1)和步骤(2)所述的接种和转接，其接种和转接的菌液体积为脱脂乳体积的1～5％。
33.另外，发酵乳制备过程中，还可根据本领域常规操作引入其他因素，比如发酵原料脱脂乳中添加适量的蔗糖等。
34.本发明具有以下有益效果：
35.本发明提供一株格氏乳杆菌菌株ckcc 1913。
36.(1)菌株ckcc 1913的菌悬液、细胞代谢物和细胞内容物对二肽基肽酶-4 酶活的抑制率分别为12.56％、83.75％和13.50％；对α-葡萄糖苷酶活的抑制率分别为5.11％、5.66％和6.34％，可应用于制备降糖药和防治糖尿病的药物。
37.(2)菌株ckcc 1913的菌悬液、细胞代谢物和细胞内容物对dpph自由基清除率分别为15.68％、25.47％和16.45％，可应用制备抗氧化产品；另外，其也具有一定的还原力，还原力分别为0.6113、0.6337和0.6063。
38.(3)该菌株制备发酵乳，在4℃条件下储藏21天的过程中，发酵乳中的 ckcc 1913活菌数始终维持在108cfu/ml，酸度变化不超过20
°
t。
39.(4)格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)是益生菌的一种，属于卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的格氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)ckcc 1913不会给人体带来任何副作用，用于制备食品、药品时安全性高。
附图说明
40.图1为菌株ckcc 1913的系统发育树。
41.图2为菌株ckcc 1913在ph2.5的模拟胃液中的存活率图。
42.图3为菌株ckcc 1913对黏蛋白的粘附能力图；
43.图4为菌株ckcc 1913的菌悬液、细胞代谢物、细胞内容物对二肽基肽酶
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4活性的抑制率图；
44.图5为加热处理前后菌株ckcc 1913的细胞代谢物对二肽基肽酶-4活性抑制的变化图
45.图6为菌株ckcc 1913的菌悬液、细胞代谢物、细胞内容物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率图。
46.图7为菌株ckcc 1913的菌悬液、细胞代谢物、细胞内容物的dpph自由基的清除率图。
47.图8为菌株ckcc 1913的菌悬液、细胞代谢物、细胞内容物的还原能力检测结果图。
48.图9为发酵脱脂乳在货架期内的菌株ckcc 1913活菌数和酸度变化图，其中a显示活菌数变化情况，b显示酸度变化。
具体实施方式
49.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
50.实施例1：格氏乳杆菌的分离与鉴定
51.1.样品采集
52.申请人团队从新疆采集牧民自制发酵羊乳样本，取样过程配戴手套并进行消毒操作，避免接触样品以防污染。将样品放入无菌离心管密封后，立即冷藏保存。
53.2.菌株分离
54.将发酵羊乳样本十倍梯度稀释后，选取适当的多个梯度稀释液，均匀涂布于 mrs培养基固体平板上，将平板倒置于37℃培养箱中厌氧培养48h；从不同梯度涂布的培养平板中挑选单菌落转接培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株，命名为ckcc 1913。
55.3.菌株的鉴定
56.本发明菌株ckcc 1913在mrs培养基固体平板上的菌落呈现白色、表面不光滑、干扁圆形。革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性。
57.本发明菌株ckcc 1913的最适生长ph为6.0～7.0；最适生长温度为37℃， 15℃及以下不能生长。
58.本发明菌株ckcc 1913能发酵葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖，不能代谢乳糖；发酵蔗糖时产酸、不产气。
59.本发明菌株ckcc 1913委托有资质的第三方实验室经16s rdna测序，利用ckcc 1913的16s rdna序列结果和标准株进行比对分析(mega7.0)构建系统发育树(图1)，显示ckcc 1913与格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)亲缘关系最近。
60.因此，菌株ckcc 1913鉴定为格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)，该菌株 ckcc 1913已于2021年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno. 23175。
61.实施例2：菌株ckcc 1913对模拟胃液的耐受能力
62.取培养18h的格氏乳杆菌菌株ckcc 1913培养液于8000r/min，4℃，10min 离心收集菌体，用无菌生理盐水溶液洗涤2～3次，离心收集菌体，重新悬浮于 ph 2.5的模拟胃液中，空白对照组重悬于无菌生理盐水中。37℃培养2h，分别在0h(只需取空白对照组)，0.5h、1h、1.5h、2h计算乳酸菌的存活率。存活率计算公式如下所示：
63.存活率(％)＝[log cfu nt/log cfu nc]
×
100％
[0064]
其中，nt：处理后的乳酸菌数量；nc：0h空白对照组乳酸菌数量。
[0065]
结果：菌株ckcc 1913在ph 2.5的模拟胃液中孵育不同时长的存活率如图 2所示。ckcc 1913在ph 2.5的模拟胃液中孵育2h后，其存活率可达80.55％。
[0066]
实施例3：菌株ckcc 1913对模拟肠液耐受能力
[0067]
取培养18h的格氏乳杆菌菌株ckcc 1913培养液于8000r/min，4℃，10min 离心收
集菌体，用无菌生理盐水溶液洗涤2～3次，离心收集菌体，重新悬浮于含 0.3％胆盐、ph为8模拟肠液中，空白对照组重悬于无菌生理盐水中。置于37℃恒温培养箱中孵育6h后计数乳酸菌的存活率。存活率计算公式与上述方法相同。
[0068]
结果：菌株ckcc 1913在含0.3％胆盐、ph为8模拟肠液中孵育6h后,其存活率可达42.44％。
[0069]
实施例4：菌株ckcc 1913的粘附能力
[0070]
格氏乳杆菌菌株ckcc 1913离心洗涤2～3次后，重悬于无菌生理盐水中，调整菌悬液的浓度为109cfu/ml。将菌悬液添加到底部铺满并固定了粘蛋白的微孔板中，阳性对照加入鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)(大量研究表明黏附性良好)。空白对照孔加入无菌生理盐水。置于37℃恒温孵育2h。孵育完毕后，取出用含0.05％吐温20的pbs清洗三次，除去未黏附细菌。再于55℃烘箱中干燥1h后，加入0.1％结晶紫溶液，染色45min。之后用pbs清洗6次。最后加入无水乙醇，静置10min，释放染液，通过酶标仪测定各孔在595nm波长下的吸光度。
[0071]
结果：由图3可知，空白对照组、阳性对照组和菌株ckcc 1913测定的吸光度值分别为0.141、0.513和0.272。菌株ckcc 1913的吸光度值是空白组的两倍多，表明ckcc 1913具备一定的粘附能力。
[0072]
实施例5：菌悬液、细胞代谢物和细胞内容物的制备
[0073]
格氏乳杆菌菌株ckcc 1913于mrs培养基中37℃静置培养18h后，4℃、 8000r/min离心10min收集菌体。用无菌磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph 6.8)洗涤 2次，菌体重悬于pbs中，并将细菌浓度调至1
×
109cfu/ml，作为菌悬液待用。将浓度调至109cfu/ml的乳杆菌至于37℃孵育12h后，4℃、8000r/min离心 10min，将上清液通过0.22μm水系微滤膜过滤以获得细胞代谢物，-80℃保存。
[0074]
将浓度调至109cfu/ml的乳杆菌在冰水浴条件下超声破碎。超声破碎 15min，每间隔1min暂停1min。超声后的破碎液在4℃、8000r/min离心10min，将上清液通过0.22μm的滤膜过滤以获得细胞内容物，-80℃保存。
[0075]
另外，相同的方法制备鼠李糖乳杆菌的菌悬液、细胞代谢物和细胞内容物。
[0076]
实施例6：格氏乳杆菌菌株ckcc 1913对二肽基肽酶-4的抑制作用
[0077]
取无菌96孔微量滴定板，在反应孔中加入25μl 1.6mmol/l甘氨酰-脯氨酰
ꢀ‑
对硝基苯和25μl菌悬液或细胞代谢物或细胞内容物；于37℃孵育10min，再加入50μl 10u/l二肽基肽酶-4；37℃反应60min，最后加入100μl 1mol/l 醋酸钠缓冲溶液(ph 4.0)终止反应，使用酶标仪在波长405nm处检测反应溶液的吸光度。每个样品做3个及以上平行。抑制率计算如式所示：
[0078]
抑制率(％)＝(1－(a样品-样品空白)/(a阳性-a阴性))
×
100
[0079]
式中：阳性为甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺+tris-hcl缓冲液(100mmol/l， ph 8.0)+二肽基肽酶-4+醋酸钠缓冲溶液；
[0080]
阴性为甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺+tris-hcl buffer(100mmol/l，ph 8.0) +tris-hcl buffer+醋酸钠缓冲溶液；
[0081]
样品为甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺+样品+二肽基肽酶-4+醋酸钠缓冲溶液；
[0082]
样品空白为甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺+样品+tris-hcl buffer(100 mmol/l，
ph8.0)+醋酸钠缓冲溶液。
[0083]
结果：由图4可知，菌株ckcc1913的细胞代谢物对二肽基肽酶-4酶活有非常高的抑制作用，抑制率为83.75％，显著高于鼠李糖乳杆菌细胞代谢物的对二肽基肽酶-4抑制作用(10.75％)。
[0084]
菌株ckcc1913菌悬液和细胞内容物对二肽基肽酶-4活性也具有一定的抑制作用，抑制率别为12.56％和13.50％，与鼠李糖乳杆菌菌悬液和细胞内容物对二肽基肽酶-4酶活的抑制率基本无异。
[0085]
对菌株ckcc1913细胞代谢物分别进行70℃和100℃的水浴加热，加热时间为20min。由图5可知，热处理后的ckcc1913细胞代谢物对二肽基肽酶-4的抑制作用有所降低，但仍保留相对较高的抑制活性。抑制率降低程度随着加热温度升高而增大。
[0086]
实施例7：格氏乳杆菌菌株ckcc1913对α-葡萄糖苷酶抑制
[0087]
取96孔无菌酶标板，反应体系为100μl。向反应孔中加入25μl20mmol/lpnpg(4-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside)和25μl菌悬液或细胞代谢物或细胞内容物；于37℃孵育10min，再加入50μl0.2u/ml的α-葡萄糖苷酶；37℃反应30min，最后加入100μl0.1mol/lna2co3溶液终止反应，将反应液于405nm处测其吸光值(a)。每个样品做三个平行。抑制率计算如下式所示：
[0088]
抑制率(％)＝(1－(a样品-样品空白)/(a阳性-a阴性))
×
100
[0089]
式中：阳性为pnpg+pbs(0.1mol/l，ph6.8)+α-葡萄糖苷酶+na2co3；
[0090]
阴性为pnpg+pbs(0.1mol/l，ph6.8)+pbs(0.1mol/l，ph6.8)+na2co3；
[0091]
样品为pnpg+样品+α-葡萄糖苷酶+na2co3；
[0092]
样品空白为pnpg+样品+pbs(0.1mol/l，ph6.8)+na2co3。
[0093]
结果：由图6可知，菌株ckcc1913菌悬液、细胞代谢物和细胞内容物对α-葡萄糖苷酶活的抑制率虽然均低于鼠李糖乳杆菌(5.18％、8.15％和11.52％)，但是均具备明显的α-葡萄糖苷酶活的抑制活性，抑制率分别为5.11％、5.66％和6.34％。
[0094]
实施例8：菌株ckcc1913的抗氧化能力
[0095]
取1ml样品和1ml0.2mmol/ldpph自由基溶液，震荡混匀；室温条件下避光反应30min；6000r/min离心10min，提上清于517nm波长条件下测定样品吸光值(od值)。每组重复三次，取平均值。按照以下公式计算dpph自由基的清除率：
[0096]
dpph清除率(％)＝[1
–
(样品
–
样品空白)/对照]
×
100
[0097]
式中，样品为菌悬液或细胞代谢物或细胞内容物；样品空白为用1ml无水乙醇取代1mldpph反应的od值；对照为无水乙醇替代样品反应的吸光值。
[0098]
结果：由图7可知，菌株ckcc1913菌悬液、细胞代谢物和细胞内容物均对dpph自由基具有一定的清除作用，细胞代谢物清除率(25.47％)大于菌悬液(15.68％)和细胞内容物清除率(16.45％)。鼠李糖乳杆菌的菌悬液、细胞代谢物和细胞内容物对dpph自由基清除率分别为12.81％、7.28％和20.18％。
[0099]
实施例9：菌株ckcc1913的还原能力
[0100]
在反应体系中(2mlep管)分别加入200μl菌悬液或细胞代谢物或细胞内容物、200μl1％的铁氰化钾、200μlpbs(0.1mol/l，ph7.2～7.4)，混匀；于50℃水浴反应20min后；冰水浴将样品迅速冷却，迅速加入200μl10％三氯乙酸；3000r/min离心10min，取100μl上
清液加入100μl 0.1％的氯化铁(用96 孔板作为反应体系)，反应10min；于700nm处测od值，吸光度越大还原力越大。
[0101]
结果：由图8可知，菌株ckcc 1913和鼠李糖乳杆菌的细胞代谢物均具有较好的还原性，吸光度值分别为0.6337和0.6467。菌株ckcc 1913和鼠李糖乳杆菌的菌悬液和细胞内容物还原能力相对较弱。
[0102]
实施例10：无蔗糖发酵乳的制备
[0103]
挑取平板上适量格氏乳杆菌ckcc 1913菌泥接种于2ml冻存管(10％脱脂奶粉复原乳)中，37℃培养24h。以培养好的冻存管为种子，按3％的接种量接种于10％的脱脂乳中培养24h制备成种子液。以3％的接种量接种于200ml的 10％脱脂乳中，然后在37℃恒温培养，当ph值降至4.5左右时终止发酵。机械破乳(400转，1min)后，分装至于4℃冰箱冷藏。分别于储藏的第1天、6天、 15天和21天，测定冷藏发酵乳的活菌数和酸度。
[0104]
结果：经测定在21天的低温储藏期内，发酵乳中的ckcc 1913活菌数一直维持在108cfu/ml，第21天的酸度相比于第1天升高了12.98
°
t(图9a)。
[0105]
实施例11：5％蔗糖添加量的发酵乳
[0106]
挑取平板上适量格氏乳杆菌ckcc 1913菌泥接种于2ml冻存管(添加了5％蔗糖的10％脱脂奶粉复原乳)中，37℃培养24h。以培养好的冻存管为种子，按 3％的接种量接种于添加了5％蔗糖的10％的脱脂乳中培养24h制备成种子液。以 3％的接种量接种于200ml的添加了5％蔗糖的10％脱脂乳中，然后在37℃恒温培养，当ph值降至4.5左右时终止发酵。机械破乳(400转，1min)后，分装至于4℃冰箱冷藏。分别于储藏的第1天、6天、15天和21天，测定冷藏发酵乳的活菌数和酸度。
[0107]
结果：经测定在21天的低温储藏期内，含蔗糖发酵乳中的ckcc 1913活菌数同样一直维持在108cfu/ml，第21天的酸度相比于第1天升高了16.32
°
t(图 9b)。
[0108]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。