一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法与流程

1.本技术属于生物技术领域，具体涉及一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法。


背景技术：

2.烟叶醇化是烟草加工过程中改善烟叶品质的一个重要环节。烟叶醇化机理主要包括酶作用、微生物作用和化学作用3个方面。其中，微生物作用贯穿于烟叶发酵和醇化的整个过程，微生物可利用烟叶中的有机成分，特别是淀粉、果胶、蛋白质、纤维素和木质素等大分子物质，通过某些代谢途径最终将有机大分子成分转化为小分子物质，进而改善烟叶风味和品质。因此，有很多研究者致力于这些可降解有机大分子物质的微生物的分离和应用研究。
3.烟叶醇化过程中，微生物菌群所具有的与品质相关的功能基因在大分子有机物质降解和转化过程中起着非常重要的作用，是影响烟叶品质的关键因素之一。挖掘和利用微生物基因资源，通过发酵获得生物酶制剂，专一性地催化降解淀粉、果胶、蛋白质、纤维素和木质素等大分子物质，是提高低次烟叶吸食品质的一种重要途径。采用传统的纯培养方法是当前微生物研究的主要思路，获得微生物活体并进行培养后才能开展后续的利用研究，开发微生物产品。但是，自然界中99％以上的微生物处于不可培养或未培养状态，现阶段所开展的微生物分离培养获得的菌株种类和数量较少，严重阻碍了微生物资源的充分利用。宏基因组技术克服了传统培养法的缺陷，可直接提取环境样本中的dna进行测序，并准确获得样品微生物物种信息，拓宽了功能性微生物筛选的面，使得大量不可培养的微生物基因资源得以充分利用，为寻找新基因、挖掘和利用更多的微生物资源提供了便利的工具。目前，该技术已运用于土壤中微生物酶的发酵及次级代谢产物抗菌物质的获得等方面的研究，但对于烟叶中微生物资源利用的研究甚少。
4.从醇化烟叶中尽可能完整地分离与富集微生物是进行宏基因组测序的前提，也是全面认识醇化烟叶微生物群落的结构和功能的基础。然而，由于醇化烟叶表面的微生物数量相对较少，大大增大了微生物洗脱的难度和效率。因此，提高醇化烟叶表面微生物的分离和富集效率是目前研究亟需解决的问题。这就需要一种适用于醇化烟叶的快速、有效洗脱和分离微生物的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服醇化烟叶微生物难洗脱、难分离的问题，提供一种快速、高效、适用于醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法，尽可能完整地保持微生物群落的物种多样性。为解决上述技术问题，本发明提出的醇化烟叶表面微生物的分离和富集方案为：
6.(1)醇化烟叶表面微生物的洗脱：将15～18g的醇化烟叶置于1l无菌锥形瓶中，加入350～380ml灭菌的磷酸缓冲液、无菌石英砂和玻璃珠，控制烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15～18:1～5:1～3。以200rpm的转速在15℃低温摇床中震荡振荡1.5h，得到烟叶表面
微生物洗脱液；
7.(2)微生物菌体的富集：将无菌操作台紫外灭菌20min后，在操作台中，用橡皮筋将孔径30～120μm的无菌纱布固定在步骤(1)中装有微生物洗脱液的瓶口，将洗脱液过滤至无菌烧杯中，然后倒入无菌细口塑料瓶中。用10cm
×
3cm的parafilm封口膜固定直径为50mm、孔径为0.22μm的无菌水系微孔滤膜于塑料瓶瓶口，并将塑料瓶倒置于瓶口直径为60mm的广口三角瓶中。使用酒精灯烧过的剪刀在塑料瓶液体上方5～6cm处打一个小孔，在无菌操作台中倒置过夜，微生物便富集到滤膜上。所使用的细口塑料瓶瓶身光滑，瓶身高为16cm，瓶底部长为10cm，宽为7.5cm，容量刻度为1l，瓶口直径为35mm。
8.(3)微生物菌体的纯化：使用无菌镊子将步骤(2)中滤膜收集于15ml无菌离心管中，加入3～4颗直径为3mm的无菌钢珠和5ml无菌磷酸盐缓冲液，置于si漩涡混合仪上，将滤膜上的微生物进行振荡15min。洗脱后，用无菌镊子将滤膜取出，将微生物悬浮液转移至无菌1.5ml离心管中，先以2000rpm的速度离心2min，除去大分子杂质，转移上清至新的离心管中，再以12000rpm的速度离心3min，倒掉上清，收集微生物沉淀。
9.本发明方法对醇化烟叶微生物进行过滤富集和洗涤纯化，步骤简单，容易操作，富集效率高，适用于醇化烟叶微生物的富集和纯化。
10.术语解释：
11.本发明中，如无特别说明，“醇化烟叶”是指经烟叶采收、烘烤、复烤后，为了去掉烟叶的青杂味和改善香吃味等品质，对烟叶进行的改善操作于一定的环境条件下储存一段时间所得到的烟叶。醇化烟叶的醇化可以通过人工醇化方式和自然醇化两种方式中的一种方式来进行方式。
12.本发明中，如无特别说明，“微生物”是指包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体。它们个体微小，与人类关系密切，涵盖了有益跟有害的众多种类。微生物共划分为8大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体。有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝、香菇等。还有微生物是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”。
13.在第一方面，本技术提供了一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法，所述方法包括：
14.(1)将醇化烟叶与磷酸缓冲液、石英砂和玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液；
15.(2)过滤步骤(1)获得的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于第一容器中，把微孔滤膜固定在所述第一容器的口，将所述第一容器倒置于第二容器中，即获得分离的微生物；
16.任选地，将步骤(2)中的微孔滤膜收集于第三容器中，加入钢珠和磷酸缓冲液，振荡、洗脱并离心，即获得富集的微生物。
17.如前所述的方法，所述方法包括：
18.(1)将醇化烟叶置于无菌锥形瓶中，加入灭菌的磷酸缓冲液、无菌石英砂和玻璃珠，在低温摇床中振荡后，获得烟叶表面微生物洗脱液；
19.(2)使用纱布过滤步骤(1)中所得到的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于无菌细口塑料瓶中，把微孔滤膜固定在瓶口，将塑料瓶倒置于广口三角瓶中，过夜，微生物富集
到滤膜上，即获得分离的微生物；
20.(3)将步骤(2)中滤膜收集于15ml无菌离心管中，加入无菌钢珠和灭菌的磷酸缓冲液，置于振荡器上，将滤膜上的微生物进行振荡洗脱后，离心，收集微生物沉淀，即获得富集的微生物。
21.如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述醇化烟叶的质量为15～18g。
22.如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述磷酸缓冲液包含137mmol/l nacl，10mmol/l na2hpo4，2mmol/l kh2po4，并且所述磷酸缓冲液的ph为7.4。
23.如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的加入量为每15～18g醇化烟叶中加入300～400ml磷酸缓冲液。在某些实施方案中，所述所述磷酸缓冲液的加入量为每15～18g醇化烟叶中加入350～380ml磷酸缓冲液。
24.如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，醇化烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15～18:1～5:1～3。
25.在某些实施方案中，在所述步骤(1)中，将15～18g醇化烟叶与350～380ml磷酸缓冲液、1～5g石英砂和1～3g玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液。
26.在某些实施方案中，在所述步骤(1)中，将15～18g醇化烟叶置于无菌锥形瓶中，加入350～380ml灭菌的磷酸缓冲液、1～5g无菌石英砂和1～3g玻璃珠，在低温摇床中振荡后，获得烟叶表面微生物洗脱液。
27.如前所述的方法，其中，所述步骤(1)中，醇化烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15～18:2～4:1.5～2.5。
28.在某些实施方案中，在所述步骤(1)中，将15～18g醇化烟叶与350～380ml磷酸缓冲液、2～4g石英砂和1.5～2.5g玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液。
29.在某些实施方案中，在所述步骤(1)中，将15～18g醇化烟叶置于无菌锥形瓶中，加入350～380ml灭菌的磷酸缓冲液、2～4g无菌石英砂和1.5～2.5g玻璃珠，在低温摇床中振荡后，获得烟叶表面微生物洗脱液。
30.如前所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述纱布的孔径为30～120μm。
31.如前所述的方法，其中，所述步骤(2)中，细口塑料瓶瓶身高为16cm，瓶底部长为10cm，宽为7.5cm，容量刻度为1l，瓶口直径为35mm。
32.如前所述的方法，其中，所述步骤(2)中，微孔滤膜为无菌水系滤膜，孔径为0.22μm，直径为50mm。
33.如前所述的方法，其中，所述步骤(2)中，广口三角瓶容量刻度为1l，口内径大小为60mm。
34.如前所述的方法，其中，所述步骤(3)中，钢珠直径为3mm，加入量为3～4颗。
35.如前所述的方法，其中，所述步骤(3)中，磷酸缓冲液的加入量为每管5ml。
36.如前所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所用振荡器为美国si漩涡混合仪vortex genie2，振荡时间为15min。
37.有益效果：
38.本发明技术方案与现有技术方案相比，提供了一种快速、高效、且尤其适用于醇化
烟叶的表面微生物分离和富集方法。并且，该方法能够尽可能完整地保持微生物群落的物种多样性。
附图说明
39.图1为采用本技术方法(滤膜过滤法)及对照方法(滤膜抽滤法)分别对醇化烟叶表面微生物进行分离和富集后，所得微生物基因组dna的电泳结果图。
40.图2为控制变量法研究不同石英砂质量对醇化烟叶表面微生物基因组提取所得dna浓度的影响结果图。
41.图3为控制变量法研究不同玻璃珠质量对醇化烟叶表面微生物基因组提取所得dna浓度的影响结果图。
具体实施方式
42.下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的限定。本发明中所用原料均为可购买的常用原料；设备均为可购买的常用设备。
43.实施例1
44.从仓库a中采取2019年湖北产区的醇化烟叶样品，分别采用两种微生物富集方法进行富集，一种是目前现有技术中常用的方法，将其作为对照方法；一种是本技术的方法。比较两种方法的结果和效率，每个处理做三个重复。
45.将15g的醇化烟叶置于1l无菌锥形瓶中，加入350ml灭菌的磷酸缓冲液、2g无菌石英砂(20～40目)和1.5g无菌玻璃珠(直径0.4～0.6mm)。以200rpm的转速在15℃低温摇床中振荡1.5h，得到烟叶表面微生物洗脱液。用橡皮筋将孔径30～120μm的无菌纱布固定在装有微生物洗脱液的锥形瓶瓶口，将洗脱液过滤至无菌烧杯中，得到约300ml洗脱液。然后，使用以下两种方法进行微生物的富集。
46.对照方法(滤膜抽滤法)：采用组合式玻璃溶剂过滤器(过滤杯300ml，过滤瓶1000ml)和0.22μm滤膜进行常温抽滤。由于抽滤过程中的真空压力较大，且洗脱液中的杂质较多，导致滤膜的孔很容易被堵住。因此，每抽50ml左右的洗脱液之后，绝大部分滤膜孔就会被堵住，导致抽滤速度极慢，如果再加50ml进行抽滤，所需要的时间大概为1～1.5h，之后需要换一张新的滤膜继续抽滤。所以，300ml的洗脱液，抽滤时间大概需要4～4.5h，需要三张滤膜。之后再将三张滤膜分别置于三个15ml无菌离心管中，加入无菌钢珠和5ml无菌磷酸盐缓冲液进行15min的振荡洗脱。洗脱后，用无菌镊子将三张滤膜取出，将微生物悬浮液转移至无菌1.5ml离心管中，先以2000rpm的速度离心2min，除去大分子杂质，转移上清至新的离心管中，再以12000rpm的速度离心3min，倒掉上清，收集微生物沉淀。所需时间大概为30min。总共的操作时间为5h左右，且全程需要操作人员监控抽滤的进度与时间。
47.本技术方法(滤膜过滤法)：使用细口塑料瓶倒置的方法进行滤膜过滤。将300ml洗脱液倒入无菌细口塑料瓶中，用10cm
×
3cm的parafilm封口膜固定直径为50mm、孔径为0.22μm的无菌水系微孔滤膜于塑料瓶瓶口，并将塑料瓶倒置于瓶口内径为60mm的广口三角瓶中。使用酒精灯烧过的剪刀在塑料瓶液体上方5cm处打一个小孔，在无菌操作台中倒置过夜。这个操作过程大概需要20min左右，只需要一张滤膜。之后，将滤膜置于15ml无菌离心管
中，加入无菌钢珠和5ml无菌磷酸盐缓冲液进行15min的振荡洗脱。然后，用无菌镊子将滤膜取出，将微生物悬浮液转移至无菌1.5ml离心管中，先以2000rpm的速度离心2min，除去大分子杂质，转移上清至新的离心管中，再以12000rpm的速度离心3min，倒掉上清，收集微生物沉淀。所需时间大概为20min。总共的操作时间为40min左右。这大大提高了工作效率，而且能够同时对多个样品进行处理。
48.将上述两种富集方法得到的微生物沉淀置于1.5ml ep管中，按照omega bio
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tek公司的土壤dna提取试剂盒(m5635
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02)进行基因组抽提。电泳图如图1所示。图中，编号为m的泳道为marker，编号为1～3的泳道为本技术方法(滤膜过滤法)，编号为4～6的泳道为对照方法(滤膜抽滤法)。实验结果表明本技术方法得到的微生物dna条带更亮，说明富集的微生物基因组质量和浓度均更高。
49.实施例2
50.本技术方法适用于所有醇化烟叶微生物的分离。例如，不同产地、不同仓储地点的醇化烟叶样品。对不同产地、不同仓储地点的醇化烟叶进行微生物分离和富集操作，仓储a样品为云南产区2019年片烟和河南产区2018年片烟，编号分别为a1和a2；仓储b样品为贵州产区2019年片烟和湖北产区2019年白肋烟片，编号为b1和b2。
51.分别取上述四种烟叶样品15g，置于1l无菌锥形瓶中，加入350ml灭菌的磷酸缓冲液、2g无菌石英砂和1.5g无菌玻璃珠。以200rpm的转速在15℃低温摇床中振荡1.5h，得到烟叶表面微生物洗脱液。用橡皮筋将孔径30～120μm的无菌纱布固定在装有微生物洗脱液的锥形瓶瓶口，将洗脱液过滤至无菌烧杯中，得到约300ml洗脱液。将300ml洗脱液倒入无菌细口塑料瓶中，用封口膜固定无菌水系微孔滤膜于塑料瓶瓶口，并将塑料瓶倒置于广口三角瓶中。使用酒精灯烧过的剪刀在塑料瓶液体上方5cm处打一个小孔，在无菌操作台中倒置过夜。之后，收集滤膜于15ml无菌离心管中，加入无菌钢珠和5ml无菌磷酸盐缓冲液进行15min的振荡洗脱。然后，离心，进行微生物沉淀操作。将得到的微生物沉淀置于1.5ml ep管中，按照omega bio
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tek公司的土壤dna提取试剂盒(m5635
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02)进行基因组抽提，dna浓度如表1所示。说明通过本技术方法以上四种样品中的微生物都能够得到较好地分离和富集。
52.表1.不同产地、不同仓储地点的醇化烟叶微生物分离和富集后dna提取结果
[0053][0054]
实施例3
[0055]
本实施例为了探讨醇化烟叶、石英砂和玻璃珠的质量比，利用控制变量法研究烟叶、石英砂和玻璃珠的质量对醇化烟叶表面微生物分离和富集效果的影响，具体的实验步骤如实施例1和2中所述。与上述实验步骤的区别在于分别改变醇化烟叶、石英砂或玻璃珠的质量，并研究不同方案提取的微生物dna浓度的差别。
[0056]
一、控制变量法研究醇化烟叶质量
[0057]
本实施例采用2019年湖北产区烟叶样品，探讨烟叶重量对本本技术方法的影响。
[0058]
实验结果显示，15～18g范围内的烟叶可以满足微生物量的基本要求，还可以使缓冲液的体积控制在350～380ml(可以使烟叶处于悬浮状态，能够振荡均匀)；该体积范围内的缓冲液既可以将烟叶悬浮，又可以控制过滤时间范围，刚好实现过夜过滤，早上收膜。
[0059]
二、控制变量法研究石英砂质量
[0060]
使用2019年湖北产区烟叶样品，控制烟叶质量为18g，玻璃珠质量2.0g，石英砂质量分别为0g，1g，1.5g，2g，3g，4g和5g，添加380ml磷酸缓冲液进行微生物洗脱，收集微生物菌体后按照dna提取试剂盒进行基因组抽提，所得dna浓度分别为：21.6ng/μl，38.5ng/μl，50.8ng/μl，58.3ng/μl，60.8ng/μl，50.1ng/μl，45.5ng/μl(图2)。
[0061]
三、控制变量法研究玻璃珠质量
[0062]
使用2019年湖北产区烟叶样品，控制烟叶质量为18g，石英砂质量为3.0g，玻璃珠质量分别为0g，0.5g，1.0g，1.5g，2g，2.5g和3g，添加380ml磷酸缓冲液进行微生物洗脱，收集微生物菌体后按照dna提取试剂盒进行基因组抽提，所得dna浓度分别为：28.2ng/μl，37.4ng/μl，49.5ng/μl，58.3ng/μl，62.6ng/μl，52.8ng/μl，43.1ng/μl(图3)。
[0063]
综上，通过上述实验结果证实，当醇化烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15～18:1～5:1～3时，醇化烟叶表面微生物的提取质量和浓度较高；当醇化烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15～18:2～4:1.5～2.5时，醇化烟叶表面微生物的提取质量和浓度均高于其它组，且差异显著。
[0064]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。