酿酒酵母、发酵剂及其制备方法和它们在制备发酵食品中的应用、啤酒的制备方法与流程

1.本发明涉及发酵领域，公开了一株酿酒酵母，一种发酵剂，一种发酵剂的制备方法和由该方法制备的发酵剂，所述酿酒酵母或所述发酵剂在制备发酵食品中的应用，一种啤酒的制备方法。


背景技术：

2.酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)是酒类发酵食品和发酵面食的灵魂。酿酒酵母在食品发酵过程中会面临诸如渗透压胁迫、高温或低温胁迫、酒精胁迫等多种胁迫因子的影响。环境胁迫可诱导细胞产生大量的活性氧(ros)，不仅会破坏蛋白质，而且还会引起细胞膜脂的氧化降解，造成细胞死亡，影响了酿酒酵母在发酵食品工业尤其是啤酒发酵工业的应用。
3.在酵母重复利用的多次传代及啤酒发酵过程中，酵母易受氧化胁迫自溶死亡，影响酵母的重复使用代数。另外，当超过5％的酵母死亡发生自溶时，啤酒会产生酵母味、老化味等，造成啤酒质量不可挽回的破坏。
4.选育高抗老化性的酵母菌株，增加酵母的重复使用次数，减少酵母自溶率，减少啤酒老化，有助于稳定啤酒质量，直接降低啤酒企业生产成本。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一株酿酒酵母，一种发酵剂，一种发酵剂的制备方法和由该方法制备的发酵剂，所述酿酒酵母或所述发酵剂在制备发酵食品中的应用，一种啤酒的制备方法。利用本发明酿酒酵母酿造啤酒，风味稳定，酵母味、乙醛、双乙酰味等不良风味物质含量低，能有效延缓啤酒老化；啤酒发酵10代发酵性能稳定，酵母自溶率不超过5％。
6.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株酿酒酵母saccharomyces cerevisiae，该酿酒酵母的保藏编号为cgmcc no.21162。
7.本发明第二方面提供一种发酵剂，所述发酵剂包含如上所述的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
8.本发明第三方面提供一种发酵剂的制备方法，该方法包括由如上所述的酿酒酵母在发酵培养基中进行发酵培养而制得。
9.本发明第四方面提供根据如上所述的制备方法制备的发酵剂。
10.本发明第五方面提供如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂在制备发酵食品中的应用。
11.本发明第六方面提供一种啤酒的制备方法，该方法包括：将如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂与麦汁接触并进行发酵，得到啤酒。
12.本发明的有益效果是：
13.1、安全健康：本发明的酿酒酵母是从甘肃农户家中留存的老面酵子中筛选出的可用于食品的安全菌株，绿色天然，营养健康；可广泛应用于发酵产品领域，也可用于制备发酵剂。
14.2、本发明的酿酒酵母传代性好，啤酒发酵10代发酵性能稳定，酵母死亡率不超过5％。
15.3、利用本发明酿酒酵母酿造啤酒，发酵速度快，风味稳定，酵母味、乙醛、双乙酰味、反式-2-壬醛等不良风味物质含量低，能有效延缓啤酒老化。
16.3、本发明的啤酒酿酒酵母cgmcc no.21162易于培养和制备，制备得到的发酵剂中酿酒酵母活菌浓度高。
17.本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
18.生物保藏
19.本发明提供的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.21162，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(缩写为cgmcc)。
附图说明
20.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
21.图1为本发明酿酒酵母在培养基上的菌落形态；
22.图2为本发明酿酒酵母的显微形态。
具体实施方式
23.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
24.本发明第一方面提供一株酿酒酵母saccharomyces cerevisiae，该酿酒酵母的保藏编号为cgmcc no.21162。
25.本发明的酿酒酵母是从甘肃农户家中留存的老面酵子中筛选得到的，该酿酒酵母cgmcc no.21162具有下述性质：
26.(1)形态学特征：所述酵母形状为圆形、卵圆型，直径大小介于1.5-3.0μm；在ypd固体培养基表面生长48个小时后，即能长出直径大小约3.0mm左右的菌落，菌落为有光泽的黄色白色圆点，边缘整齐，质地均匀，易挑取。
27.(2)发酵力：发酵速度快，主发酵时间为5天，真正发酵度高(86.77％)。
28.(3)传代能力强：啤酒发酵10代发酵性能稳定，酵母死亡率不超过5％。
29.(4)发酵啤酒风味稳定性好：啤酒含有异戊醇、正丙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯等风味物质成分，且在30℃处理30天后，仍能很好保留原酒风味。
30.(5)抗老化性能好：发酵得到的啤酒中，双乙酰、乙醛和反式-2-壬醛含量低，分别低于0.1mg/l、10mg/l、0.11μg/l。
31.本发明提供的酿酒酵母经过液体培养能够产生大量酿酒酵母活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述酿酒酵母增殖即可，例如可以按照10
6-108cfu/ml的接种量将酿酒酵母的活菌体接种于酿酒酵母培养基中，并且在好氧条件下，在20-25℃的温度下培养12-48小时后，得到培养液。所述酿酒酵母培养基可以为本领域公知的各种适合酿酒酵母培养的培养基，例如可以为糖蜜和/或5
°bé
麦汁和/或ypd培养基。
32.其中，ypd培养基配方优选包括：酵母膏5-15g/l，蛋白胨15-25g/l，葡萄糖15-25g/l。配制得到的ypd培养基可以在118-123℃下灭菌15-25min。当培养基为固体培养基时，优选还包含琼脂15-20g/l。
33.本发明可以进一步分离上述培养液中的酿酒酵母的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
34.本发明第二方面提供一种发酵剂，所述发酵剂包含如上所述的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
35.根据本发明，所述发酵剂的形式可以不受特别的限制，比如所述发酵剂可以为液体发酵剂、半液体发酵剂、浓缩发酵剂、压缩发酵剂或固体发酵剂。
36.其制备方法可以是本领域常规的制备方法。
37.本发明第三方面提供一种发酵剂的制备方法，该方法包括由如上所述的酿酒酵母在发酵培养基中进行发酵培养而制得。
38.根据本发明，所述发酵培养基可以为本领域常规的各种用于培养酿酒酵母的培养基，例如，可以为如上所述的ypd培养基，也可以为麦汁培养基和糖蜜培养基等各种适合于培养酿酒酵母的培养基。
39.其中，糖蜜培养基的制备方法可以为：糖蜜稀释至6-10
°ꢀbé
，添加酵母粉1-3g/l，硫酸铵0.2-0.8g/l。然后，可以在115℃高压灭菌15min制备得到。
40.在本发明的一种实施方式中，发酵剂可以是按以下方法制备得到：
41.(1)将酿酒酵母cgmcc no.21162在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到108cfu/ml以上，得到液体发酵剂；
42.(2)将步骤(1)得到的发酵液与发酵底物混合，得到半液体发酵剂；
43.(3)将步骤(1)得到的发酵菌液进行浓缩处理之后，得到浓缩或压缩酵母发酵剂；
44.(4)将步骤(1)得到的发酵菌液进行浓缩处理，之后用缓冲液进行冲洗，加入保护剂，并调整活菌浓度至10
10
cfu/ml以上，混合均匀后进行干燥，即得所述固体发酵剂。
45.(5)将上述发酵剂加入乳酸菌混合均匀后制得混合发酵剂。
46.根据本发明，方式(2)中，所述发酵底物可以根据所述发酵菌剂的预定用途不同而不同，本领域技术人员可以根据需要进行选择。
47.其中，所述底物的用量不受特别的限制，只要能够使得步骤(1)得到的液体发酵剂转变为半液体发酵剂即可。
48.根据本发明，方式(3)和(4)中，所述浓缩的方法可以为本领域常规的技术手段，只要能够实现发酵液的浓缩即可，比如，可以为离心、过滤等，只要不显著影响酿酒酵母的活性即可。
49.根据本发明，对所述发酵菌液进行离心的方法可以按照本领域常规的方法进行，
例如，可以在冷冻离心机中以5000-12000rpm的速度离心5-20min获得菌体沉淀。
50.根据本发明，方式(4)中，所述缓冲液可以是本领域常规的缓冲液，比如可以为pbs缓冲液或者生理盐水。
51.根据本发明，方式(4)中，所述干燥的方式包括但不限于冻干、烘干、风干、真空干燥和喷雾干燥等。
52.根据本发明，所述保护剂可以为本领域常规的各种保护剂，例如，可以为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油等中的至少一种。本领域技术人员可以根据需要选择并调整保护剂的用量。
53.根据本发明，所述乳酸菌可以以任意形式在任意步骤中引入，例如，在方式(2)中，所述乳酸菌可以以乳酸菌发酵液的形式与酿酒酵母的发酵液先混合，然后再引入底物，从而得到含有酿酒酵母和乳酸菌的半液体发酵剂；或者，在步骤(4)中，所述乳酸菌以浓缩后的发酵液的形式与酿酒酵母的浓缩后的发酵液先混合，然后再引入保护剂；或者，在固体发酵剂中直接加入固体形式的乳酸菌菌剂。
54.其中，所述乳酸菌可以为常规使用的对人体有益的益生菌，例如，所述乳酸菌可以选自乳杆菌、乳球菌和片球菌。优选的，所述乳酸菌为植物乳杆菌和/或戊糖片球菌。
55.根据本发明，所述乳酸菌的加入量可以在较宽的范围内选择，优选的，所述乳酸菌的加入量使得，在所得到发酵剂中，酿酒酵母和乳酸菌的活菌数的比例可以为1：(10-11-10
11
)，更优选为1：(10-4-104)。
56.根据本发明，如上对酿酒酵母cgmcc no.21162进行发酵培养的方法已经进行了详细的介绍，为了避免不必要的重复，此处不再赘述。
57.本发明第四方面提供根据如上所述的制备方法制备的发酵剂。
58.本发明第五方面提供如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂在制备发酵食品中的应用。
59.优选地，所述发酵食品为酒类发酵食品或发酵面食。
60.优选地，所述酒类发酵食品是啤酒。
61.优选地，所述发酵面食为发酵面包。
62.啤酒的发酵可以是在发酵啤酒等谷物发酵酒的常规生产过程中，把酿酒酵母cgmcc no.21162按照常规使用接种到待处理的原料(比如麦汁)中，在能够使所述酿酒酵母cgmcc no.21162繁殖的温度、压力下进行发酵或存活。通过在发酵底物中加入cgmcc no.21162，其代谢产物使发酵酒具有一定的外观、香味等优异特性，改善了产品感官品质特性。
63.本发明第六方面提供一种啤酒的制备方法，该方法包括：将如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂与麦汁接触并进行发酵，得到啤酒。
64.根据本发明，所述发酵的条件可以为本领域公知的常规的用于啤酒发酵培养的条件，例如，所述发酵培养的温度可以为10-30℃。
65.所述麦汁可以是本领域常规的使用的麦汁，其可以由大麦芽、小麦芽和黑麦芽中的至少一种作为主要原料制备得到。应当理解的是，所述麦汁中还可以还有其他辅料，本领域技术人员可以根据希望得到的风味进行选择。
66.啤酒的具体制备方法可以按照本领域常规的方法进行，在此不再赘述。
67.实施例
68.下述实施例中涉及的培养基配方如下：
69.ypd培养基(重量％)：酵母粉(1％)、蛋白胨(2％)、葡萄糖(2％)，加热溶解，121℃高压灭菌15-20min。
70.麦汁培养基：大麦芽粉碎，按照1：4的料水比添加水分，45℃保持30min，64℃保持40min，70℃保持20min，115℃高压灭菌15min。
71.在无特殊说明的情况下，使用的试剂和材料均通过商购获得。
72.在无特殊说明的情况下，操作均为本领域常规的操作。
73.用作对照菌株的商业酵母为购自安琪酵母的英式艾尔酵母cy115。
74.实施例1
75.本实施例用于说明酿酒酵母cgmcc no.21162的分离、纯化及其特性鉴定。
76.本发明所述的酿酒酵母cgmcc no.21162，分离自甘肃农户家中留存的老面酵子。
77.取老面酵子以无菌生理盐水梯度稀释至10-6
，各稀释梯度ypd平板，并于28
±
1℃培养72h。接种针挑选菌落形态各异的菌落至ypd平板划线直至出现单菌落大小均一、形态一致。
78.选择细胞形态为圆形、卵圆形，且出芽生殖的菌株。将上述分离到暂定为酵母菌的菌株在ypd液体培养基中活化3代后进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，并对酵母菌的生长，发酵性能，发酵制品外观品质特征、质构特征、发酵风味物质、感官品质等多个方面进行研究，经过多轮研究和论证，从众多野生酵母菌中最终筛选获得一株酿酒酵母菌，编号为pat-y165。
79.(1)形态学鉴定
80.将筛选的酿酒酵母，于28
±
1℃培养48小时，如图1所示，在ypd培养基上菌落圆形，表面光滑，湿润，不透明。如图2所示，酿酒酵母的显微镜下细胞形态为卵圆型。
81.(2)生理生化鉴定
82.利用法国梅里埃api鉴定系统对筛选菌株pat-y165进行生理生化鉴定，鉴定结果见下表1。经生理生化鉴定，分离菌株为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
83.表1
[0084][0085]
[注]：表中“+”代表生化反应结果为阳性，
“‑”
代表生化反应结果为阴性。
[0086]
(3)分子鉴定
[0087]
对分离菌株的its1/its4进行克隆和测序，其its1/its4基因的核苷酸序列如下，将本发明菌株的its1/its4序列与酿酒酵母菌的序列比对，本发明菌株的its1/its4序列(seq id no：1)与saccharomyces cerevisiae序列相似性达到99.99％。
[0088]
seq id no：1
[0089]
atggatttttttgttttggcaagagcatgagagcttttactgggcaagaagacaagagatggagagtccagccgggcctgcgcttaagtgcgcggtcttgctaggcttgtaagtttctttcttgctattccaaacggtgagagatttctgtgcttttgttataggacaattaaaaccgtttcaatacaacacactgtggagttttcatatctttgcaactttttctttgggcattcgagcaatcggggcccagaggtaacaaacacaaacaattttatttattcattaaatttttgtcaaaaacaagaattttcgtaactggaaattttaaaatattaaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccagggggcatgcctgtttgagcgtcatttccttctcaaacattctgtttggtagtgagtgatactctttggagttaacttgaaattgctggccttttcattggatgttttttttttccaaagagaggtttctctgcgtgcttgaggtataatgcaagtacggtcgttttaggttttaccaactgcggctaatcttttttatactgagcgtattggaacgttatcgataagaagagagcgtctaggcgaacaatgttcttaaagtttgacctcaaatcaggtaggagtacccgctg
[0090]
结合形态和生化鉴定结果，将分离菌株确定为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为cgmcc no.21662，保藏日期为2020年11月11日。
[0091]
实施例2
[0092]
本实施例用于说明酿酒酵母在啤酒发酵中的应用研究。
[0093]
分别使用本发明的酿酒酵母和对照菌株进行啤酒的酿造，并进行评价。
[0094]
(1)啤酒的酿造方法包括：用麦汁培养基活化酵母，将酵母菌液以10％的接种量接种到12
°
p麦汁培养基中，发酵温度为20℃，发酵结束后，4℃储藏至双乙酰含量符合国标要求，得到啤酒产品。使用称量法测定co2失重量，当co2失重量在0.1g/天以内表示发酵结束。
[0095]
使用本发明的酿酒酵母酿造啤酒时在发酵第5天达到发酵终点，对照菌株在第6天达到发酵终点。
[0096]
(2)啤酒真正发酵度的测定：
[0097]
称取啤酒试样100g，全部移入500ml已知质量的蒸馏瓶中，加水50ml和数粒玻璃珠，装上蛇型冷凝管，开启冷却水，用已知质量的100ml容量瓶接收馏出液(外加冰浴)，缓缓加热蒸馏(冷凝管出口水温不得超过20℃)，收集约96ml馏出液(蒸馏应在30min-60min内完成)，取下容量瓶，调整液温至20℃，准确补加水至100g，混匀。用密度瓶测定馏出液的相对密度。根据“酒精水溶液的相对密度与酒精度(乙醇含量)对照表(20℃)”、“糖溶液的相对密度和plato度或浸出物的百分含量(20℃)及原麦汁浓度经验公式校正表”求出试样的酒精度(a)及真正浓度(z)，以柏拉图度或质量分数(
°
p或％)表示。
[0098]
根据测得的酒精度和真正浓度，按下式计算试样的真正发酵度(rdf)：
[0099]
rdf＝100
×
(2.0665
×
a)/(2.0665
×
a+z)
[0100]
式中：
[0101]
rdf—试样的真正发酵度，％；
[0102]
a—试样的酒精度质量分数，％；
[0103]
z—试样的真正浓度，单位为柏拉图度或质量分数％。
[0104]
经计算，本发明的酿酒酵母酿造的啤酒的真正发酵度为86.77％，对照菌株的真正
发酵度为67.70％。
[0105]
实施例3
[0106]
本实施例用于说明酿酒酵母啤酒发酵传代能力。
[0107]
以10％接种量，分别将本发明所述的酿酒酵母和对照菌株接种到装有2l 12
°
p麦汁三角瓶中作啤酒发酵试验，20℃恒温发酵5d后收集酵母泥，记为0代。将0代酵母转接至新的麦汁培养基作第二轮啤酒发酵，发酵结束后收集酵母泥，记为1代。以此类推连续10次发酵，每次发酵结束，检测酵母细胞死亡率和真正发酵度。
[0108]
酵母死亡率检测法：0.1％次甲基蓝染色液与等量酵母菌液混合均匀后，在载玻片中央加一滴混合液并盖盖玻片；将制片放置约3min后镜检。
[0109]
酵母死亡率＝(蓝色酵母细胞/酵母细胞总数)
×
100％
[0110]
啤酒的真正发酵度的检测方法如实施例2所述。
[0111]
经测定，本发明的酿酒酵母连续10次啤酒发酵后，酵母死亡率不超过5％，啤酒的真正发酵度保持86.77
±
0.5％，发酵性能稳定。对照菌株死亡率超过6.5％，啤酒真正发酵度降低10％。
[0112]
实施例4
[0113]
本实施例用于说明酿酒酵母发酵啤酒的风味稳定性。
[0114]
实施例2酿造的啤酒产品在30℃下储存30天后，吸取啤酒溶液5ml至20ml螺口顶空进样瓶，准确加入三氯丙烷(10mg/l)内标溶液150μl，摇匀，测定其中的风味物质。
[0115]
通过气相色谱法测定啤酒中的风味物质，50/30μm dvb/car/pdms固相微萃取头及萃取手柄购自美国supelco公司；6890n-5973i气质联用仪购自美国agilent公司。
[0116]
将固相微萃取头插入气相色谱的进样口中，270℃老化1h，并进行空白实验，直至无色谱峰出现。将样品装入样品瓶，装液量为整个样品瓶容积的1/3-1/2，并加入2g氯化钠，将固相微萃取头插入样品瓶中，45℃萃取45min，在温度为270℃的气质联用仪进样口中解吸5min，进样分析。
[0117]
气相色谱(gc)条件：hp-innowax ms型色谱柱(30m
×
250μm
×
0.25μm)；载气为氦气(he)，流速1ml/min；柱温起始为50℃，保持5min，以6℃/min升温至160℃，保持3min，再以20℃/min升温至230℃；不分流进样。质谱(ms)条件：电离方式为电子电离(electron ionization，ei)源，电子能量70ev，发射电流为200μa，离子源温度为230℃，四级杆150℃，全扫描模式，扫描质量范围50～550amu，无溶剂延迟。
[0118]
准确移取浓度为1000mg/l 1,2,3-三氯丙烷标准溶液1ml，用甲醇稀释定容至100ml容量瓶，得到10mg/l三氯丙烷内标溶液；通过nist谱图库检索的方式定性样品中风味化学物质的种类。并由化合物峰面积与内标峰面积比值计算相对浓度。
[0119][0120]
x——试样中风味化合物相对含量，单位mg/l；
[0121]
vi——试样中加入内标的体积，单位ml；
[0122]
vs——顶空瓶中加入样品试液的体积，单位ml；
[0123]
ci——内标溶液的浓度，单位mg/l；
[0124]
ii——内标峰面积强度；
[0125]
is——风味化合物峰面积强度。
[0126]
经测定，本发明酿酒酵母酿造啤酒含有异戊醇、正丙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯等风味物质成分，双乙酰、乙醛和反式-2-壬醛的含量低，分别为0.08mg/l、8.96mg/l和0.10μg/l。发酵得到的啤酒30℃处理30天后，感官评价风味能很好的保留原酒风味。对照菌株酿造啤酒30℃处理30天后，双乙酰、乙醛分别低于0.1mg/l和10mg/l，但反式-2-壬醛含量为0.21μg/l。
[0127]
实施例5
[0128]
本实施例用于说明酿酒酵母在发酵面包中的应用研究。
[0129]
分别使用本发明所述的酿酒酵母和对照菌株按照以下步骤制备发酵面包。
[0130]
步骤：配料称重
→
搅打面团成膜
→
静置
→
切块、搓圆
→
静置
→
排气整形
→
醒发
→
烘烤。
[0131]
观察面包的组织状态，并测量吐司质构。焙烤好的面包冷却1小时后，切成15mm厚的吐司切片。
[0132]
全质构分析方法：
[0133]
取吐司面包心，切成1.5cm厚度薄片，使用ta.xt.plus质构仪进行全质构分析。选用p36r探头，采用tpa检测模式，测试速度为1.0mm/s，压缩到原始高度的50％，第1次和第2次压缩之间的松弛时间为5s，每个样品测5次并取平均值。实验结果如表1所示。
[0134]
表1
[0135]
菌株硬度内聚性胶粘性咀嚼性no.21162330.2820.692200.361260.006对照菌株400.4150.737295.460286.522
[0136]
本发明酿酒酵母用于焙烤面包，得到的面包相较对照菌株得到的面包更柔软。
[0137]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。