栽培茄以及野生茄种间鉴定的引物、试剂盒及检测方法

1.本发明属于分子遗传育种领域，尤其涉及一种栽培茄以及野生茄种间鉴定的引物、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.茄子属于茄科(solanaceae)茄属(solanum)植物，现代栽培茄遗传背景相对狭窄，野生种茄子(即野生茄)是茄子种质资源的重要部分。茄子的形态学性状以果实性状最为典型，茄子分类多以果实性状为依据，在茄子分类研究中，通常将栽培茄分为圆茄、卵茄及长茄等，而将野生茄单独分为一类，目前关于茄子野生种质资源的鉴定及分类研究仅限于形态特征的鉴定及描述，但是通过形态特征的鉴定准确度并不高，因此，通过挖掘功能基因序列差异并开发分子标记来鉴定栽培茄与野生茄具有重要意义。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供了一种栽培茄以及野生茄种间鉴定的引物、试剂盒及检测方法，本发明提供的方法能够准确的鉴别不同种类的茄子，且检测方法便捷。
4.本发明提供了一种seq id no.1～2所示核苷酸序列的两条引物组成的引物对。其中，正向引物dfr1046f为5’tgcttaatctggtcccatga 3’；反向引物dfr1046r为5’tttcagaaatgtaaggtaaaaagagt 3’。
5.本发明利用基因组重测序技术挖掘调控重要性状的功能基因的变异位点，进一步开发分子标记，通过聚合酶链式反应pcr扩增可简单快速对茄子种质资源进行鉴定分类，还可应用于远缘杂交后代杂交种的鉴定。
6.本发明采用一个分子标记，一种引物对即可区分栽培茄以及3个野生茄，在茄子的种质资源分类及遗传育种等方面的研究和应用方面具有重要意义。
7.本发明还提供了一种所述的引物对在制备用于栽培茄以及野生茄种间鉴定的检测试剂中的应用。
8.本发明还提供了一种用于栽培茄以及野生茄种间鉴定的检测试剂盒，包括本发明所述的引物对。所述引物对中的正向引物dfr1046f为5’tgcttaatctggtcccatga 3’；引物对中的反向引物dfr1046r为5’tttcagaaatgtaaggtaaaaagagt 3’；其中，所述试剂盒还包括pcr反应试剂。
9.本发明还提供了一种用于栽培茄以及野生茄种间鉴定的方法，包括：以栽培茄以及野生茄基因组dna为模板，以本发明所述的引物进行pcr扩增，根据扩增产物进行种间鉴定。优选的，所述种间鉴定的pcr体系包含：dna模板；引物；pcr buffer；dntp；taq dna polymersrase；无菌去离子水，更优选的，所述种间鉴定的pcr体系采用20μl的pcr反应体系，包含：50ng/μl的dna模板1μl；10μmol/l的引物对各0.4μl；10
×
pcr buffer 2μl；dntp 1.6μl；taq dna polymersrase；ddh2o 14.5μl；
10.pcr反应程序为：94℃预变性3min；35个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；12℃冷却。
11.本发明中，所述种间鉴定具体为：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以不同带型区分栽培茄及其3个野生茄：
12.如果有一条略大于1000bp的分子标记谱带且在250bp处同时出现一条分子标记谱带，则为栽培茄；
13.如果仅有一条略大于1000bp的分子标记谱带，则为大果茄；
14.如果有一条略大于1000bp的分子标记谱带且在500bp-750bp之间同时出现一条分子标记谱带，则为埃塞俄比亚茄；
15.如果在750bp-1000bp之间以及略小于500bp处同时出现两条分子标记谱带，则为毛果茄。
16.其中，由于具体实验的误差，谱带数据会有细微偏差，文中的略大于或略小于是指的是在指定值的附近。
17.本发明提供了一种栽培茄以及野生茄种间鉴定的引物、试剂盒及检测方法，本发明提供的引物对可以快速区分栽培茄及其3个野生茄。所用的标记引物扩增及琼脂糖凝胶电泳操作方便，带型简单，不需要测序直接通过扩增片段即可区分4种茄属作物，在茄子种质资源分类、利用及杂交种的鉴定方面节省人力物力，具有很好的应用前景。
附图说明
18.图1为5份供试材料表型图；其中，c134：大果茄(solanum macrocarpon)；c153：毛果茄(solanum viarum)；11-435：栽培茄(solanum melongena)；11-587：埃塞俄比亚茄(solanum aethiopicum)；07-1043：未知茄属材料，经本发明标记引物鉴定后为毛果茄(solanum viarum)；
19.图2为标记引物dfr1046f/dfr1046r在5份供试材料中的扩增结果。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例
22.1.供试材料
23.用于展示本发明分子标记引物的扩增结果的材料有5份，5份材料如图1所示，图1为5份供试材料表型图；其中，c134：大果茄(solanum macrocarpon)；c153：毛果茄(solanum viarum)；11-435：栽培茄(solanum melongena)；11-587：埃塞俄比亚茄(solanum aethiopicum)；07-1043：未知茄属材料，经本发明标记引物鉴定后为毛果茄(solanum viarum)。
24.2.标记开发
25.利用重测序数据与茄子参考基因组(http：//eggplant.kazusa.or.jp/)对包含
dfr基因上游启动子区1046bp，下游终止子区312bp，基因编码区1638bp总计3000bp的区域进行比对，查找差异位点。根据比对预测到的差异片段，基于茄子参考基因组序列，采用primer3plus进行引物设计，得到正向引物dfr1046f为5’tgcttaatctggtcccatga 3’；反向引物dfr1046r为5’tttcagaaatgtaaggtaaaaagagt 3’。
26.3.基因组dna的提取
27.取上述供试材料茄子植株的新鲜幼嫩叶片，放入加有不锈钢珠的2ml离心管中，在液氮冷冻下使用研磨仪迅速将叶片研磨成粉末状，立即向离心管中加入600ul65℃预热的ctab提取液，剧烈震荡混匀，65℃水浴1h；冷至室温后加入等体积的24：1的氯仿/异戊醇，轻轻摇匀至溶液呈乳浊液，10000rpm离心10min，该过程再重复一次；用剪去的枪头将上清液缓缓转移到盛有2/3体积预冷异丙醇的1.5μl离心管中，-20℃沉淀2h以上；4℃10000rpm离心5min，去上清液，用70％乙醇洗涤1～2次，每次离心5min，超净工作台上吹干；用150ul无菌水，1.5μlrnaase溶解dna备用。
28.4.利用pcr技术对预测到的差异片段进行扩增
29.20μl的pcr反应体系，包含：50ng/μl的dna模板1μl；10μmol/l的引物对各0.4μl；10
×
pcr buffer 2μl；dntp 1.6μl；taq dna polymersrase 0.1μl；ddh2o14.5μl。pcr反应程序为：94℃预变性3min；35个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；12℃冷却。
30.5.琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果
31.称取0.7g琼脂糖溶于70ml 0.5
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tbe电解液中，微波炉加热溶解，并加入7μl gelred核酸染料，封好边后倒胶，插梳子。20μl pcr产物中加入4μl 6
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loading buffer混匀，待琼脂糖胶凝固后，将pcr产物加入琼脂糖凝胶，设置电泳仪120v，80ma，50w，30min，启动；待电泳完成后，将琼脂糖凝胶至于凝胶成像仪中成像后，分析条带。成像后的结果如图2所示，图2为标记引物dfr1046f/dfr1046r在5份供试材料中的扩增结果。
32.以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。