植物乳杆菌、菌剂及其制备方法和它们的应用、发酵食品及其制备方法与流程

1.本发明涉及发酵领域，公开了一株植物乳杆菌、一种菌剂、一种菌剂的 制备方法以及根据该方法制备的菌剂、所述植物乳杆菌或所述菌剂在制备发 酵食品、饲料和饵料中的应用、一种发酵食品的制备方法和一种发酵食品。


背景技术：

2.乳酸菌(lacticacidbacteria,lab)是一类能利用可发酵性碳水化合物， 产生大量乳酸的有益细菌的总称。乳酸菌及其代谢产物具有延缓衰老、调节 血脂、降低胆固醇、提高免疫力、抑制肿瘤和改善胃肠道菌群环境等多方面 的保健作用。
3.乳酸菌数量庞杂、种类繁多、分布广泛。现有数据显示，乳酸菌至少包 括18属，约200多种。在中国，乳酸菌广泛存在于青海、西藏、内蒙、新 疆、四川、贵州、辽宁、湖南、云南等地传统发酵制品中，如酸奶、泡菜、 老面头等。这些传统发酵制品是分离天然益生菌的巨大菌种宝库。
4.植物乳杆菌是乳酸菌中广泛应用于食品生产的一大类。研究表明：植物 乳酸菌的产酸能力、发酵速度及风味特征是影响发酵乳制品、发酵谷物制品、 发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵饲料等品质重要因素。因此，产酸特性是 确定乳酸菌是否具有重要商业应用价值的重要依据。
5.一般而言产酸能力强的乳酸菌，其后酸化(后酸化是指乳酸发酵中止后 菌株在冷却和冷藏阶段的继续产酸)的趋势也强。产酸快、产酸量大的乳酸 菌能够带来较低的最终产品发酵酸度，这是保证低后酸化(如酸化麦芽)的 有效措施。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了提供产酸能力强的乳酸菌，提供一株植物乳杆菌、 一种菌剂、一种菌剂的制备方法以及根据该方法制备的菌剂、所述植物乳杆 菌或所述菌剂在制备发酵食品、饲料和饵料中的应用，该植物乳杆菌具有生 长速率快、产酸速度高、发酵风味良好的特点，将其应用于酸化麦芽、发酵 乳制品、豆制品、果蔬制品和饲料制品中，提高发酵产品的品质。
7.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，该植物乳杆菌的保藏号为cgmccno.21157。
8.本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的植物乳杆菌 (lactobacillusplantarum)。
9.本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，该菌剂由如上所述的植物乳 杆菌在发酵培养基中进行发酵培养后制得。
10.本发明第四方面提供根据如上所述的方法制备得到的菌剂。
11.本发明第五方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在制备 发酵食
品、饲料和饵料中的应用。
12.本发明第六方面提供一种发酵食品的制备方法，该方法包括将如上所述 的植物乳杆菌或如上任意一项所述的菌剂与发酵底物相接触。
13.本发明第七方面提供一种发酵食品，所述发酵食品根据如上所述的方法 制备得到。
14.通过本发明的技术方案，能够获得如下的有益效果：
15.1、安全健康、成本低廉：本发明提供的植物乳杆菌是从山西农家老面 头中筛选出的可用于食品的安全菌株，无化学添加，绿色天然，营养健康；
16.2、本发明提供的植物乳杆菌cgmcc no.21157具有生长速率快、产酸 速度高、发酵风味良好的特点；用于制备发酵食品、饲料和饵料等制品时， 可有效产品酸度，改善产品风味特性，并能提高发酵制品品质，对产品感官 品质特性具有良好的改善作用；
17.3、本发明提供的植物乳杆菌用于制备菌剂时，易于培养和制备，菌剂 植物乳杆菌活菌浓度高。
18.本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
19.生物保藏
20.本发明提供的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，于2020年11月 11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 cgmcc no.21157，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所(缩写为cgmcc)。
附图说明
21.图1为本发明所述的植物乳杆菌的菌落形态。
22.图2为本发明实施例3中所述植物乳杆菌在麦汁培养基中的生长曲线和 产酸曲线。
23.图3为本发明实施例3中对照菌株在麦汁培养基中的生长曲线和产酸曲 线。
具体实施方式
24.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这 些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各 个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点 值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视 为在本文中具体公开。
25.本发明第一方面提供一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，该植 物乳杆菌的保藏号为cgmccno.21157。
26.本发明所述的植物乳杆菌cgmccno.121157，是从山西农家老面头中 筛选得到的。
27.所述的植物乳杆菌cgmcc no.21157具有下述性质：
28.(1)形态学特征：如图1所示，在mrs培养基上菌落呈乳白到浅黄色， 圆形，表面光滑，湿润，不透明；显微镜下细胞形态为短杆状，革兰氏染色 阳性。
29.(2)本发明提供的植物乳杆菌的16s rdna序列如seqidno.1所示，与 ncbi植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的序列比对，相似性达到99％。
30.seqidno.1：
2天。经过斜面培养的植物乳杆菌 可以恢复活力，用于后续的培养和发酵。
41.本发明提供的植物乳杆菌经过液体培养能够产生大量植物乳杆菌活菌 体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述植物乳杆菌增殖即可， 例如可以按照10
6-108cfu/ml的接种量将植物乳杆菌菌体接种于植物乳杆菌 培养基中，并且在厌氧或好氧条件下，在15-40℃的温度下培养12-72h后， 得到培养液。
42.所述植物乳杆菌培养基可以为本领域公知的各种适合植物乳杆菌培养 的培养基，例如可以为麦芽汁、牛奶和/或乳酸菌(mrs)培养基。
43.其中，mrs培养基优选包括：蛋白胨0.5-1.5重量％，牛肉浸膏0.3-0.8 重量％，酵母粉0.2-0.6重量％，葡萄糖1-3重量％，吐温80 0.05-0.2重量％， k2hpo4.7h2o 0.1-0.3重量％，乙酸钠
·
3h2o 0.4-0.6重量％，柠檬酸三铵0.1-0.4 重量％，mgso4·
7h2o 0.01-0.05重量％，mnso4·
4h2o 0.001-0.01重量％，ph 为6-6.5。121℃高压灭菌15-20min。当培养基为固体培养基时，优选还包含 琼脂1.5-2重量％。
44.其中，麦汁液体培养基的制备方法可以为将干麦芽磨碎后与水混合，麦 芽与水的重量比为1:6-10，混合物在60-80℃水浴锅中糖化1-2h至基本完全 糖化(糖化程度可用碘滴定法确定)，得到糖化液。将糖化液用4-6层纱布 过滤后，再将滤液稀释到5-6波美度，ph自然，即可得到麦汁液体培养基。
45.其中，麦芽可以包括但不限于大麦芽、小麦芽、燕麦芽、青稞麦芽、荞 麦芽等。
46.本发明可以进一步分离上述培养液中的植物乳杆菌的活菌体，所述分离 的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过 离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件， 本发明在此不再赘述。
47.本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的植物乳杆菌 (lactobacillusplantarum)。
48.根据本发明，所述菌剂的形式可以不受特别的限制，比如可以为液体菌 剂、半液体菌剂、浓缩菌剂或固体菌剂。其中，固体菌剂可以是干燥菌剂， 例如，可以为冻干菌剂、喷雾干燥菌剂等。
49.其中，所述半液体菌剂是指浓缩后的发酵液或者是和发酵底物混合的发 酵液，固体菌剂可以是干燥制备得到的菌剂，例如，可以为冻干菌剂、喷雾 干燥菌剂或真空干燥菌剂等。
50.优选地，所述菌剂中的活菌数为108cfu/ml以上，更优选为109cfu/ml 以上。
51.本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，该菌剂由如上所述的植物乳 杆菌在发酵培养基中进行发酵培养后制得。
52.优选地，所述菌剂以液体菌剂、半液体菌剂、浓缩菌剂或固体菌剂的形 式存在。
53.优选地，该方法包括：将如上所述的植物乳杆菌在发酵培养基中进行培 养，并使活菌数达到108cfu/ml以上，得到的发酵液即为菌剂a。
54.根据本发明，所述发酵培养基可以是本领域常规的发酵培养基，比如可 以为如上所述的麦汁或mrs培养基，也可以是在麦汁、mrs培养基的基础 上优化的各种适合于发酵乳酸菌的培养基。
55.根据本发明，所述发酵的条件可以为本领域公知的常规的用于乳酸菌发 酵培养的条件，例如，所述发酵培养的温度可以为15-45℃。
56.根据本发明，优选地，该方法还包括对如上所述的发酵液进行进一步处 理，得到菌剂。
57.优选地，所述处理的方式选自如下所示的方式的一种：
58.(1)将得到的发酵液和底物混合得到菌剂b；
59.(2)对得到的发酵液进行浓缩，得到菌剂c；
60.(3)对得到的发酵液进行浓缩和干燥，得到菌剂d。
61.应当理解的是，菌剂a为液体形态的菌剂，菌剂b为半液体菌剂，菌 剂c为浓缩菌剂，菌剂d为固体形式存在的菌剂。
62.根据本发明，方式(1)中，所述底物可以根据所述发酵菌剂的预定用 途不同而不同，例如，当所述菌剂预定用于酸麦芽时，则所述底物变为待发 酵的相应底物。其中，所述底物包括但不限于大麦芽、小麦芽、燕麦芽、青 稞麦芽、荞麦芽。
63.其中，所述底物的用量不受特别的限制，只要能够使得步骤(1)得到 的液体菌剂转变为半液体菌剂即可。
64.根据本发明，方式(2)和(3)中，所述浓缩的方法可以为本领域常规 的技术手段，只要能够实现发酵液的浓缩即可，比如，可以为离心、过滤等， 只要不显著影响植物乳杆菌的活性即可。
65.根据本发明一种优选的实施方式，对所述发酵菌液进行离心以得到菌剂 c。所述离心，例如，可以在冷冻离心机中以5000-12000rpm的速度离心 5-20min获得菌体沉淀，从而得到菌剂c。
66.根据本发明，方式(3)中，所述干燥的方式包括但不限于冻干、烘干、 风干、真空干燥和喷雾干燥等。
67.在本发明的一种优选的实施方式中，所述干燥的方式包括：向浓缩后的 物料中加入保护剂，并调整活菌浓度至10
10
cfu/ml以上，并将所得混合物料 干燥后得到菌剂d。
68.根据本发明，所述保护剂可以为本领域常规的各种保护剂，例如，可以 为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油等中的至少一种。本领域技 术人员可以根据需要选择并调整保护剂的用量。
69.根据本发明，优选地，在向所述浓缩菌剂中加入冻干保护剂之前，优选 的，该方法还包括使用缓冲液对所述浓缩菌剂进行洗涤。其中，所述缓冲液 可以为本领域常规的用于对菌体进行冲洗的缓冲液，例如，可以为生理盐水 或pbs缓冲液。
70.在本发明的一种优选的实施方式中，所述菌剂为固体菌剂，所述菌剂的 制备方法包括：
71.(1)将如上所述的植物乳杆菌在发酵培养基中进行发酵培养，并使活 菌数达到108cfu/ml以上，得到发酵液；
72.(2)将步骤(1)得到的发酵液进行离心处理，得到菌泥；
73.(3)将菌泥与冻干保护剂混合，并调整活菌浓度至10
10
cfu/ml以上， 冷冻干燥后，得到所述菌剂。
74.所述菌剂的产品形态可以包括但不限于胶囊、片剂、口服液和粉剂。
75.本发明第四方面提供根据如上所述的方法制备得到的菌剂。
76.本发明第五方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在制备 发酵食
品、饲料和饵料中的应用。
77.根据本发明，所述发酵食品优选自发酵乳制品、发酵谷物制品、发酵豆 制品、发酵果蔬汁和发酵面食中的至少一种。
78.其中，所述发酵面食可以为馒头、面包、包子、发饼或发糕，发酵谷物 制品可以为酸化麦芽或酸麦汁。
79.优选地，所述发酵食品为酸麦芽或酸麦汁。
80.本发明所述的植物乳杆菌cgmccno.21157在发酵食品方面的应用，在 本发明的实施方式中，是在生产发酵谷物制品及由此生产酸化麦芽的常规生 产过程中，把植物乳杆菌cgmccno.21157按照常规使用接种到待处理的原 料中，在能够使所述植物杆菌cgmccno.21157繁殖的温度、压力下进行发 酵或存活。通过在发酵底物中加入cgmccno.21157，其代谢产物使发酵制 品具有一定的酸度、香味等优异特性，同时使产品延长了保藏时间，改善了 产品营养价值和风味特性。
81.本发明第六方面提供一种发酵食品的制备方法，该方法包括将如上所述 的植物乳杆菌或如上任意一项所述的菌剂与发酵底物相接触。
82.根据本发明，本领域技术人员可以根据预定的发酵食品的种类将所述植 物乳杆菌或菌剂接种到相应的发酵底物中发酵制备发酵食品。
83.所述发酵食品可以为酸麦芽，优选地，发酵底物选自大麦芽、小麦芽、 燕麦芽、青稞麦芽和荞麦芽中的至少一种。
84.所述发酵食品的制备方法为本领域常规的制备方法，在此不再赘述。
85.本发明第七方面提供一种发酵食品，所述发酵食品根据如上所述的方法 制备得到。
86.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
87.mrs培养基(man rogosa sharpe broth)：蛋白胨1重量％，牛肉粉0.5 重量％，酵母粉0.4重量％，葡萄糖2重量％，吐温80 0.1重量％，k2hpo4.7h2o 0.2重量％，乙酸钠
·
3h2o 0.5重量％，柠檬酸三铵0.2重量％，mgso4·
7h2o 0.02 重量％，mnso4·
4h2o 0.005重量％，琼脂粉1.5重量％，加热溶解，调节ph 至6.2
±
0.2，121℃高压灭菌15-20min。
88.mc液体培养基：大豆蛋白胨0.5重量％，牛肉粉0.3重量％，酵母粉0.3 重量％，葡萄糖2重量％，乳糖2重量％，碳酸钙1重量％，琼脂1.5重量％， 1％中性红溶液0.5重量％。将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节ph至6.0
±
0.2，加入中性红溶液，分装后121℃高压灭菌15-20min。
89.在无特殊说明的情况下，使用的试剂和材料均通过商购获得。
90.在无特殊说明的情况下，操作均为本领域常规的操作。
91.用作对照菌株的商业植物乳杆菌为购自lallemand公司的植物乳杆菌。
92.实施例1
93.本实施例用于说明植物乳杆菌cgmccno.21157的分离、纯化及其特性 鉴定。
94.菌株：植物乳杆菌cgmccno.21157分离自山西农家自用老面团。
95.从山西太原、大同等县市的农家中采集传统方法制作的馒头的老面团样 品，以无菌生理盐水梯度稀释至10-6
，各稀释梯度依次涂mrs平板和mc 平板，并于36
±
1℃培养72h。接种针挑选菌落形态各异的菌落至mrs平板 和mc平板划线直至出现单菌落大小均一、形态
ggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaat gatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggccc aaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgat ggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaa agaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaag ccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtc cggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagc cttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagag gacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacacca gtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggt agcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagt gttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctgg ggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagc ggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgac atactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtg gtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgag cgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccg gtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacc tgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagt aagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctaca tgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttccc gggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggt ggggtaaccttttaggaaccagccgcctaagtggacaagaaggg
108.结合生化分析结果，将该菌株鉴定为植物乳杆菌 (lactobacillusplantarum)。
109.将分离菌株确定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，命名为 lactobacillusplantarumpat-l85，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院 微生物研究所，其保藏编号为cgmccno.21157，保藏日期为2020年11月 11日。
110.实施例2
111.本实施例用于说明植物乳杆菌cgmccno.21157的遗传稳定性研究。
112.为了对cgmccno.21157的产酸性能进行考察，将试验菌种接到液体 mrs培养基中，37℃培养24-48h，当菌种恢复活力后，将菌种按4体积％ 比例接种到传代培养基中(全脂奶粉配成12重量％复原乳溶液，加入6重 量％白砂糖混匀、煮沸10min)，37℃发酵。牛奶凝固后，记录发酵时间， 同时测定酸度。连续传代10次后实验结果如表2所示。
113.表2
114.编号发酵时间/h发酵终点ph滴定酸度％10代133.60
±
0.514.41
±
0.321代103.45
±
0.674.52
±
0.78
115.可见，菌株cgmccno.21157连续传代10次后，发酵乳的发酵终点ph 为3.50左右，滴定酸度为4.45，遗传产酸能力相对稳定。
116.实施例3
117.本实施例用于说明乳酸菌产酸能力的测定研究
118.将分离纯化的乳酸菌活化镜检后接种于装有麦汁培养基的密闭容器中， 37℃恒温培养，每3-5h取出40ml培养液，用精密酸度计测ph值，共测69h。
119.以时间为横坐标，发酵培养液细胞浓度及酸度值为纵坐标，得到菌株生 长及产酸
动态变化曲线见图2。
120.从图2可看出，本发明的菌株cgmccno.21157发酵24h后基本达到 对数生长期的末期，将进入稳定期，此时发酵液酸度为5.4％(ph3.34)。 24-69h虽然菌体浓度基本无明显增长，但总酸产量还在上升，在35h时酸度 达到6.8％，50h时接近7.5％，此后一直维持在7.5％的水平。
121.按照相同的方法培养对照菌株(如图3示)，接种之后在24h时到达稳 定期，其od略低于本发明的菌株，酸度达到5.4％的水平，与本发明的菌株 相当。但随时间延长，其od值基本不变化，在50h时酸度达到6.8％，此后 一直维持在该水平，比本发明的菌株低0.7％。
122.实施例4
123.本实施例用于说明植物乳杆菌在发酵谷物饮料方面的应用。
124.分别使用本发明所述的植物乳杆菌、对照菌株、lld(乳酸乳球菌乳酸 亚种丁二酮变种)、lll(乳酸乳球菌乳酸亚种)和llc(乳酸乳球菌乳油 亚种)制备发酵谷物饮料。
125.选择色泽好，新鲜饱满，无病虫害的谷物原料，按照大麦：水＝1:1-1:2 的范围将谷物原料进行浸泡，至其含水量为40重量％左右。
126.取浸泡好的原料，沥干水分，于15℃发芽4d后于70℃烘干至含水量5％ 左右，得到大麦麦芽。将原料使用麦芽标准磨(0.2mm间距)粉碎后，加入 重量8倍、65℃热水进行糖化处理1-1.5h，得到糖化液。将糖化液冷却后， 使用中速滤纸过滤，得麦汁培养基。向麦汁培养基中加入植物乳杆菌，发酵 培养一段时间，使其浓度达到108cfu/ml以上，然后加入白砂糖、柠檬酸、 稳定剂、香精等调整风味后进行冷却灌装即得，对其感官进行评价，评价标 准见表3所示。
127.表3
[0128][0129][0130]
以复合谷物发酵饮料的色泽、风味、状态为评分标准，从不同品种的商 业乳酸菌中选择最佳的发酵菌种，发酵菌种选择的对应感官评价得分如下表 4所示。
[0131]
表4
[0132]
发酵菌种色泽滋、气味外观总分lld16201147lll20331366llc18271257本发明菌株27421887
对照菌株25401681
[0133]
通过对不同发酵剂发酵的谷物发酵饮料进行感官评分，可知在相同的发 酵条件下，不同发酵剂在很大程度上影响着实验结果，其中本发明所述的菌 株发酵得到的谷物饮料色泽淡黄、均一；组织状态均匀，无分层现象；具有 谷物复合香气及愉悦的发酵风味，口感很独特。
[0134]
实施例5
[0135]
本实施例用于说明植物乳杆菌在生产菌剂中的应用。
[0136]
植物乳杆菌cgmccno.21157按照2-4％(v/v)的接种量接种麦汁培养 基中，在37-42℃下培养20-24h，使植物乳杆菌cgmccno.21157活菌数达 到108cfu/ml以上，离心(4000rpm，10min)，用ph6.5-7.5的pbs缓冲液 冲洗沉淀两次后，加入脱脂乳和海藻糖等作为冻干保护剂，调整细胞浓度至 109cfu/ml，混合均匀后进行真空冷冻干燥得到活菌制剂。活菌制剂含有活菌 数在10
8-10
10
cfu/ml，该菌剂可直接加入到发酵制品中进行发酵，也可按常 规方法加入合适的辅料制成食品工业或临床可接受的剂型，剂型包括胶囊剂、 微胶囊剂、片剂、粉剂等各种剂型。
[0137]
以上述筛选出的植物乳杆菌制成的活菌制剂，还包括通过驯化等技术手 段保持菌种活性的产品。
[0138]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在 本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包 括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样 应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。