1.本发明涉及肝素钠的精制工艺，尤其涉及一种降低肝素钠中硫酸皮肤素含量的方法。
背景技术：
2.肝素钠(heparin sodium)为抗凝血药，是一种粘多糖类物质，由猪、牛、羊的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖钠盐，在人体内由肥大细胞分泌，自然存在于血液中。肝素钠具有防止血小板集聚和破坏、抑制纤维蛋白原转变成纤维蛋白单体、抑制凝血活素的形成和对抗已形成的凝血活素、阻止凝血酶原转变成凝血酶和对抗凝血酶等作用。肝素钠在体内体外均能延缓或阻止血液凝固。目前，肝素钠最常见的原料来源便是猪小肠，通过刮取小肠粘膜、酶解、吸附、层析等步骤制备粗品肝素钠；然而，粗品肝素钠需要进一步精制才能应用于临床患者。
3.目前，肝素钠的精制工艺主要分为两类：盐解
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树脂吸附法和酶解
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树脂吸附法，其中硫酸皮肤素是其主要的杂质。cn110713558a公开了一种肝素钠的提取工艺，包括如下步骤：原料处理、加热酶解、冷却吸附、洗脱、沉淀、脱水干燥；然而，上述工艺提取得到的肝素钠存在硫酸皮肤素含量过高的问题。而根据其他专利文件及文献中肝素钠精制的方式进行肝素钠生产，结果发现，其硫酸皮肤素虽然合格但含量接近合格线2.0％。cn201410396942.6公开了一种控制肝素钠原料中硫酸皮肤素和硫酸软骨素总含量的方法，采用2次氯化钠盐解、过氧化叔丁醇氧化、异丙醇沉淀可以有效的去除肝素钠原料中的硫酸皮肤素和硫酸软骨素并可以将其总含量降至0.1％以下；但上述方法并没有兼顾去除核酸需求，以至于会出现核酸不合格的问题。在保障肝素钠原料中各项杂质含量均符合药典标准的基础上，尽可能的降低硫酸皮肤素的含量，其更具有实际生产意义。
4.鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种降低肝素钠中硫酸皮肤素含量的方法，该方法可显著降低肝素钠中硫酸皮肤素的含量；本发明的另一目的在于提供利用该方法制得的肝素钠。
6.具体地，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供一种降低肝素钠中硫酸皮肤素含量的方法，包括：将待处理的肝素钠溶解、并将得到的肝素钠溶解液进行酶解，离心后取上清液进行碱化处理，再次离心后取上清液进行梯度层析；
8.其中，在进行梯度层析时，采用阴离子层析柱，依次使用3
±
0.1％的氯化钠溶液、5
±
0.1％的氯化钠溶液、7
±
0.1％的氯化钠溶液、18
±
0.1％的氯化钠溶液进行洗脱，收集18
±
0.1％的氯化钠溶液的洗脱液。
9.现有技术中，多采用层析的方法将硫酸皮肤素为主的有关物质通过5～9％的氯化钠溶液从肝素钠中洗脱出来；然而，若氯化钠浓度太低，则硫酸皮肤素去除不彻底，有关含
量不合格；若氯化钠浓度太高则肝素钠会被洗脱下来。
10.本发明以降低肝素钠中硫酸皮肤素含量为研发目的，尝试了大量的层析工艺，在研发过程中发现，采用梯度层析的方式有望降低肝素钠中硫酸皮肤素的含量。
11.进一步在进行梯度层析过程中，采用阴离子层析柱，并依次使用3
±
0.1％的氯化钠溶液、5
±
0.1％的氯化钠溶液、7
±
0.1％的氯化钠溶液、18
±
0.1％的氯化钠溶液进行洗脱，可显著降低肝素钠中硫酸皮肤素含量。
12.具体而言，3
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱的目的是平衡柱子以及去除部分碱化离心后仍残留的核酸蛋白；硫酸皮肤素主要在5
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱的过程中除去，但根据传统工艺做法以及其他专利文件的实验方法，所生产的肝素钠精品中有关物质含量低于2％但高于1％(甚至接近2％)，一旦经过工艺放大，其有关物质含量便很容易出现不合格的现象；在上述洗脱步骤的基础上，通过进一步的7
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱，即可以去除残留的硫酸皮肤素又能避免肝素钠被洗脱下来；最终使用18
±
0.1％的氯化钠溶液进行洗脱、并收集18
±
0.1％的氯化钠溶液的洗脱液，即可显著降低肝素钠中硫酸皮肤素含量。
13.为了进一步降低肝素钠中硫酸皮肤素的含量，本发明对梯度层析的步骤进行了优化，具体如下：
14.作为优选，所述阴离子层析柱的体积为所述肝素钠溶解液体积的1.5～2.5倍；
15.进一步地，当使用3
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱时，洗脱体积为阴离子层析柱体积的1～3倍；
16.进一步地，当使用5
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱时，洗脱至流出液醇检澄清；
17.进一步地，当使用7
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱时，洗脱体积为阴离子层析柱体积的1～2倍；
18.进一步地，当使用18
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱时，洗脱至流出液醇检澄清。
19.在上述技术方案中，“醇检澄清”具体指：层析即时流出液用95％的乙醇溶液进行检测，检测至无浑浊。
20.作为优选，所述方法还包括：对所述洗脱液进行氧化脱色；
21.进一步地，所述氧化脱色具体为：将所述洗脱液的ph值调至9.5～10.5，而后加入双氧水，在室温条件下搅拌4～8h；
22.更进一步地，所述双氧水的浓度为25～35％；以所述洗脱液的体积为基准，所述双氧水的添加量为2～4％。
23.作为优选，所述方法还包括：将经氧化脱色处理后的洗脱液进行醇沉；
24.进一步地，所述醇沉具体为：将经氧化脱色处理后的洗脱液的ph调至6.0～8.0，加入乙醇，在3～5℃下静置23～25h，而后在3～5℃、3500～4500rpm下离心10～20min；
25.更进一步地，所述乙醇的浓度不低于90％；所述乙醇的添加量为经氧化脱色处理后的洗脱液的1～2倍。
26.作为优选，采用3
±
0.1％的氯化钠溶液溶解待处理的肝素钠；以g/ml计，待处理的肝素钠：3
±
0.1％的氯化钠溶液＝1：14～16。
27.进一步地，所述溶解在40～50℃下进行。
28.作为优选，所述酶解的酶为胰蛋白酶；以g/ml计，胰蛋白酶：肝素钠溶解液＝1：8000～12000；
29.进一步地，所述酶解在ph为7.0～9.0的条件下进行；
30.更进一步地，所述酶解的时间为5～8h。
31.作为优选，两次离心均在3～5℃、3500～4500rpm下进行10～20min。
32.作为优选，所述碱化处理具体为：将第一次离心后的上清液的ph值调至10.0～13.0，而后在不低于95℃条件下加热10～20min，冷却至室温；优选以5m的氢氧化钠溶液为ph调节剂。
33.作为本发明的较佳技术方案，所述方法包括如下步骤：
34.(1)采用3
±
0.1％的氯化钠溶液溶解待处理的肝素钠，得肝素钠溶解液；
35.其中，以g/ml计，待处理的肝素钠：3
±
0.1％的氯化钠溶液＝1：14～16；
36.(2)将胰蛋白酶加入所述肝素钠溶解液，在ph为7.0～9.0的条件下酶解5～8h；
37.其中，以g/ml计，胰蛋白酶：肝素钠溶解液＝1：8000～12000；
38.(3)将酶解后的肝素钠溶解液在3～5℃、3500～4500rpm下离心10～20min，得上清液i；
39.(4)采用5m的氢氧化钠溶液将所述上清液i的ph值调至10.0～13.0，而后在不低于95℃条件下加热10～20min，冷却至室温；在3～5℃、3500～4500rpm下离心10～20min，得上清液ii；
40.(5)将所述上清液ii进行梯度层析；
41.其中，在进行梯度层析时，采用体积为所述肝素钠溶解液体积1.5～2.5倍的阴离子层析柱，先使用3
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱，洗脱体积为阴离子层析柱体积的1～3倍；再使用5
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱，洗脱至流出液醇检澄清；而后使用7
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱，洗脱体积为阴离子层析柱体积的1～2倍；最后使用18
±
0.1％的氯化钠溶液洗脱，洗脱至流出液醇检澄清，收集18
±
0.1％的氯化钠溶液的洗脱液；
42.(6)将所述洗脱液的ph值调至9.5～10.5，而后加入浓度为25～35％双氧水，在室温条件下搅拌氧化脱色4～8h；
43.其中，以所述洗脱液的体积为基准，所述双氧水的添加量为2～4％；
44.(7)将经氧化脱色处理后的洗脱液的ph调至6.0～8.0，加入浓度不低于90％的乙醇，在3～5℃下静置23～25h，而后在3～5℃、3500～4500rpm下离心10～20min；
45.其中，所述乙醇的添加量为经氧化脱色处理后的洗脱液的1～2倍。
46.如此，本发明通过特定的溶解、酶解、一次离心、碱化、二次离心、梯度层析、氧化脱色、醇沉等步骤，有效降低肝素钠中硫酸皮肤素的含量。
47.本发明还提供一种肝素钠，该肝素钠由以上所述的方法制得。
48.本发明的有益效果在于：
49.本发明提供的方法解决了传统市售肝素钠精品中硫酸皮肤含量偏高的问题；具体而言，本发明通过特定的处理方法、尤其是控制梯度层析，最终达到最大限度去除硫酸皮肤素的目的，使得硫酸皮肤素含量由原来的1.2～1.8％，降低至0.22～0.83％。
具体实施方式
50.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
51.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，
或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
52.实施例1
53.本实施例提供一种降低肝素钠中硫酸皮肤素含量的方法，包括如下步骤：
54.(1)称取40.08g粗品肝素钠，用600ml 3％的氯化钠溶液(称取18.16g氯化钠固体，用纯化水溶解并定容至600ml)溶解，并用40℃水浴加热搅拌进行促溶，得肝素钠溶解液；
55.(2)称取胰蛋白酶60.03mg，在搅拌条件下缓慢加入到肝素钠溶解液中，在ph值为8.63的条件下搅拌酶解8h；
56.(3)将酶解后的肝素钠溶解液分装入1l的离心桶内，于4℃、4000rpm条件下离心10min，取上清液i；
57.(4)采用5m的氢氧化钠溶液将上清液i的ph值调至11.82，而后在100℃水浴锅中加热10min，冷却至室温；
58.(5)将碱化后的肝素钠溶解液分装入1l的离心桶内，在4℃、4000rpm条件下离心10min，得上清液ii；
59.(6)测量上清液ii体积为566ml，将上清液ii上样至1l柱体积的阴离子层析柱内，随后降低流速，先使用3％的氯化钠溶液洗脱，洗脱1.5l后，再使用5％的氯化钠溶液洗脱，洗脱2.0l后，层析即时流出液用95％的乙醇溶液进行检测，检测结果为微浑，又洗脱400ml后，醇检澄清，而后使用7％的氯化钠溶液洗脱，洗脱1.2l，最后使用18％的氯化钠溶液洗脱，层析即时流出液用95％的乙醇溶液进行检测，检测结果为澄清，停止洗脱，收集18％的氯化钠溶液的洗脱液(2400ml)；
60.(7)将洗脱液的ph值调至9.80，而后加入72ml 30％的双氧水，并于室温(25℃)条件下搅拌氧化脱色4h；
61.(8)将经氧化脱色处理后的洗脱液的ph调至7.02，加入2500ml95％的乙醇，在4℃条件下过夜醇沉24h，而后在4℃、4000rpm条件下离心15min后，弃上清，留沉淀；
62.(9)将沉淀于40℃恒温烘箱内烘干16h后，用纯化水溶解并分置于适合的冻干盒内，于冻干机内冻干47h；即得精品肝素钠。
63.本实施例制得的精品肝素钠24.65g，效价约为210iu，其硫酸皮肤素含量为0.22％。
64.实施例2
65.本实施例提供一种降低肝素钠中硫酸皮肤素含量的方法，包括如下步骤：
66.(1)称取40.23g粗品肝素钠，用600ml 3％的氯化钠溶液(称取18.09g氯化钠固体，用纯化水溶解并定容至600ml)溶解，并用40℃水浴加热搅拌进行促溶，得肝素钠溶解液；
67.(2)称取胰蛋白酶60.04mg，在搅拌条件下缓慢加入到肝素钠溶解液中，在ph值为8.80的条件下搅拌酶解8h；
68.(3)将酶解后的肝素钠溶解液分装入1l的离心桶内，于4℃、4000rpm条件下离心10min，取上清液i；
69.(4)采用5m的氢氧化钠溶液将上清液i的ph值调至12.61，而后在100℃水浴锅中加热10min，冷却至室温；
70.(5)将碱化后的肝素钠溶解液分装入1l的离心桶内，在4℃、4000rpm条件下离心
10min，得上清液ii；
71.(6)测量上清液ii体积为593ml，将上清液ii上样至1l柱体积的阴离子层析柱内，随后降低流速，先使用3％的氯化钠溶液洗脱，洗脱1.5l后，再使用5％的氯化钠溶液洗脱，洗脱2.0l后，层析即时流出液用95％的乙醇溶液进行检测，检测结果为澄清，而后使用7％的氯化钠溶液洗脱，洗脱1.2l，最后使用18％的氯化钠溶液洗脱，层析即时流出液用95％的乙醇溶液进行检测，检测结果为澄清，停止洗脱，收集18％的氯化钠溶液的洗脱液(2400ml)；
72.(7)将洗脱液的ph值调至10.20，而后加入72ml 30％的双氧水，并于室温(25℃)条件下搅拌氧化脱色4h；
73.(8)将经氧化脱色处理后的洗脱液的ph调至6.94，加入2500ml95％的乙醇，在4℃条件下过夜醇沉24h，而后在4℃、4000rpm条件下离心15min后，弃上清，留沉淀；
74.(9)将沉淀于40℃恒温烘箱内烘干16h后，用纯化水溶解并分置于适合的冻干盒内，于冻干机内冻干47h；即得精品肝素钠。
75.本实施例制得的精品肝素钠25.12g，效价约为230iu，其硫酸皮肤素含量为0.83％。
76.对比例1
77.本对比例提供一种降低肝素钠中硫酸皮肤素含量的方法，包括如下步骤：
78.(1)称取40.14g粗品肝素钠，用600ml 3％的氯化钠溶液(称取18.07g氯化钠固体，用纯化水溶解并定容至600ml)溶解，并用40℃水浴加热搅拌进行促溶，得肝素钠溶解液；
79.(2)称取胰蛋白酶60.22mg，在搅拌条件下缓慢加入到肝素钠溶解液中，在ph值为7.92的条件下搅拌酶解8h；
80.(3)将酶解后的肝素钠溶解液分装入1l的离心桶内，于4℃、4000rpm条件下离心10min，取上清液i；
81.(4)采用5m的氢氧化钠溶液将上清液i的ph值调至11.47，而后在100℃水浴锅中加热10min，冷却至室温；
82.(5)将碱化后的肝素钠溶解液分装入1l的离心桶内，在4℃、4000rpm条件下离心10min，得上清液ii；
83.(6)测量上清液ii体积为575ml，将上清液ii上样至1l柱体积的阴离子层析柱内，随后降低流速，先使用3％的氯化钠溶液洗脱，洗脱1.5l后，再使用5％的氯化钠溶液洗脱，洗脱2.3l后，层析即时流出液用95％的乙醇溶液进行检测，检测结果为澄清，最后使用18％的氯化钠溶液洗脱，层析即时流出液用95％的乙醇溶液进行检测，检测结果为澄清，停止洗脱，收集18％的氯化钠溶液的洗脱液(2400ml)；
84.(7)将洗脱液的ph值调至10.32，而后加入72ml 30％的双氧水，并于室温(25℃)条件下搅拌氧化脱色4h；
85.(8)将经氧化脱色处理后的洗脱液的ph调至7.10，加入2500ml95％的乙醇，在4℃条件下过夜醇沉24h，而后在4℃、4000rpm条件下离心15min后，弃上清，留沉淀；
86.(9)将沉淀于40℃恒温烘箱内烘干16h后，用纯化水溶解并分置于适合的冻干盒内，于冻干机内冻干47h；即得精品肝素钠。
87.本对比例制得的精品肝素钠28.35g，效价约为230iu，其硫酸皮肤素含量为
1.80％。
88.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。