一种rna编辑系统及其编辑方法与应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种rna编辑系统及其编辑方法与应用。
背景技术：
2.对目标rna进行编辑具有很大的应用前景：首先，在探索基因功能中的应用：后基因组时代阐明基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。rna编辑技术可以快速、经济、简便的以序列特异方式对目的基因表达调控以及对其表达产物进行一个修改，已经成为探索基因功能的重要研究手段。对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。
3.其次，rna编辑技术在基因治疗领域中的应用：rna降解技术作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用rnai技术对hiv
‑
1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有bcl/abl或aml1/mtg8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如htert启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的表达或产物进行编辑，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。
4.最后，病毒性疾病的治疗：加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用rnai技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这些结果提示rna降解技术能胜任许多病毒的基因治疗，rna降解技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。
5.目前对rna编辑有基于cas13或dcas13为基础的rna编辑技术，这些技术的效率比较高，但是由于它们的分子量比较大，而且脱靶及旁切效果比较严重，制约了其在基因治疗中的应用。
技术实现要素：
6.针对上述技术问题，本发明提供一种rna编辑系统及其编辑方法与应用，能有效解决上述现有技术不足之处。
7.为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种rna编辑系统，包括重组rna编辑酶和指引rna，且所述重组rna编辑酶包括两个蛋白结构域，一个是与rna结合的蛋白结构域，另一个是对rna进行编辑的酶；所述指引rna包括两段序列，一段是识别序列，所述识别序列与重组rna编辑酶的rna结合的蛋白结构域，另一段是反义序列，所述反义序列通过碱基互补配对原则与靶标rna结合，从而实现对靶标rna的编辑。
8.优选的，所述与rna结合的蛋白结构域为pp7cp或hiv1 rna转运蛋白rev，其中，
pp7cp的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：ktivlsvgeatrtlteiqstadrqifeekvgplvgrlrltaslrqngaktayrvnlkldqadvvdcstsvcgelpkvrytqvwshdvtivansteasrkslydltkslvatsqvedlvvnlvplgrhiv1 rna转运蛋白rev的氨基酸序列如 seq id no.2所示，具体如下：magrsgdsdeelirtvrlikllyqsnpppnpegtrqarrnrrrrwrerqrqihsiserilgtylgrsaepvplqlpplerltldcnedcgtsgtqgvgspqilvesptvlesgtke优选的，所述对rna进行编辑的酶为降解rna的rna酶或对rna进行碱基修饰的酶类。
9.进一步优选的是，所述对rna进行编辑的酶包括具有双链特异的rna酶、mcpip1蛋白的rna酶活性结构域、催化rna碱基c转为碱基u的酶和催化rna碱基a转为碱基i的酶，所述具有双链特异的rna酶的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述mcpip1蛋白的rna酶活性结构域的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述催化rna碱基c转为碱基u的酶的氨基酸序列如seq id no.5所示，所述催化rna碱基a转为碱基i的酶的氨基酸序列如seq id no.6所示，其中，具有双链特异的rna酶的氨基酸序列如seq id no.3所示，具体如下：npivinrlqrklgytfnhqellqqalthrsasskhnerleflgdsilsyvianalyhrfprvdegdmsrmratlvrgntlaelarefelgeclrlgpgelksggfrresiladtvealiggvfldsdiqtveklilnwyqtrldeispgdkqkdpktrmcpip1蛋白的rna酶活性结构域的氨基酸序列如seq id no.4所示，具体如下：tpkapnlepplpeeekegsdlrpvvidgsnvamshgnkevfscrgillavnwflerghtditvfvpswrkeqprpdvpitdqhilrelekkkilvftpsrrvggkrvvcyddrfivklayesdgivvsndtyrdlqgerqewkrfieerllmysfvndkfmppddplgrhgpsldnflrkkpltlehrkqpcpygrkctygikcrffhperpscpqrsva催化rna碱基c转为碱基u的酶的氨基酸序列如seq id no.5所示，具体如下：rrafitgvfylsevefsheywmrhaltlakrawderevpvgavlvhnnrvigegwnrpigrhdptahaeimalrqgglvmqnyrlidatlyvtlepcvmcagamihsrigrvvfgardaktgaagslmdvlhhpgmnhrveitegiladecaallsdffrmrrqeikaqkkaqsstd催化rna碱基a转为碱基i的酶的氨基酸序列如seq id no.6所示，具体如下：mssetgpvavdptlrrriephefevffdprelrketcllyeinwggrhsiwrhtsqntnkhvevnfiekftteryfcpntrcsitwflswspcgecsraiteflsryphvtlfiyiarlyhhadprnrqglrdlissgvtiqimteqesgycwrnfvnyspsneahwpryphlwvrlyvlelyciilglppclnilrrkqpqltfftialqschyqrlpphilwatglk优选的，所述重组rna编辑酶还包括核定位序列，其氨基酸序列如seq id no.7所示：pkkkrkv。
10.优选的，所述重组rna编辑酶还包括柔性肽，其氨基酸序列如seq id no.8所示，所述柔性肽位于所述重组rna编辑酶的两个蛋白结构域之间，其中， 柔性肽的氨基酸序列如seq id no.8所示：ggggsggggsgggg。
11.优选的，所述重组rna编辑酶的c末端加入组蛋白纯化标签，n末端加入穿膜肽序列，所述组蛋白氨基酸序列如seq id no.9所示： cgrlwmrwyspwarrygc上述rna编辑系统的编辑方法，即应用上述的rna编辑系统，将相应功能的酶引导
到相应的rna上，实现rna的编辑。
12.上述rna编辑系统或rna编辑系统的编辑方法在敲降rna、rna碱基修改或rna病毒清除中的应用。
13.有益效果：本发明所选择的rna结合蛋白分子量较小，而且研究比较成熟，大大降低重组蛋白的分子量，适用于基因功能研究及rna病毒清除等应用；另外，用于降解靶标rna的编辑酶是一个双链特异性的rna酶，使得它对单链rna无作用，极大地减少旁切效果；该方法按照流行的分子生物学方法进行，所需要的试剂和仪器均为常用，无需特殊购买。
具体实施方式
14.下面通过具体实施例对本发明作详细说明：实施例1一种rna编辑系统，用于敲降293t细胞中ampkα亚基的mrna水平，具体过程如下：1）对rna进行编辑的酶选为靶向切割rna的酶，具体为rnc
‑
pp7cp序列，将rnc
‑
pp7cp序列构建到真核表达载体上，在同一载体把seq id no.11序列构建在u6或h1启动子后面，表达出指引rna；通过密码子优化后且于靶向降解rna的rnc
‑
pp7cp的dna序列如seq id no.10所示，具体如下：atgcccaagaagaagcgcaaggtgaaccccatcgtgatcaaccgcctgcagcgcaagctgggctacaccttcaaccaccaggagctgctgcagcaggccctgacccaccgcagcgccagcagcaagcacaacgagcgcctggagttcctgggcgacagcatcctgagctacgtgatcgccaacgccctgtaccaccgcttcccccgcgtggacgagggcgacatgagccgcatgcgcgccaccctggtgcgcggcaacaccctggccgagctggcccgcgagttcgagctgggcgagtgcctgcgcctgggccccggcgagctgaagagcggcggcttccgccgcgagagcatcctggccgacaccgtggaggccctgatcggcggcgtgttcctggacagcgacatccagaccgtggagaagctgatcctgaactggtaccagacccgcctggacgagatcagccccggcgacaagcagaaggaccccaagacccgcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcaagaccatcgtgctgagcgtgggcgaggccacccgcaccctgaccgagatccagagcaccgccgaccgccagatcttcgaggagaaggtgggccccctggtgggccgcctgcgcctgaccgccagcctgcgccagaacggcgccaagaccgcctaccgcgtgaacctgaagctggaccaggccgacgtggtggactgcagcaccagcgtgtgcggcgagctgcccaaggtgcgctacacccaggtgtggagccacgacgtgaccatcgtggccaacagcaccgaggccagccgcaagagcctgtacgacctgaccaagagcctggtggccaccagccaggtggaggacctggtggtgaacctggtgcccctgggccgcseq id no.11序列如下所示：taaggagtttatatggaaacccttagaattcaaattcaccatctgacatcatgtggatcctaaggagtttatatggaaaccctta注：加粗标注的序列为与靶序列通过反向互补原则结合的序列；两端以下划线标注序列为rnc
‑
pp7cp蛋白结合区。
15.2）把步骤1）所构建的重组载体转染至293t细胞中；3）再次培养24
‑
48小时，即可抑制ampkα亚基表达。
16.实施例2一种rna编辑系统，用于对293t细胞中ampkα亚基进行碱基c和碱基a进行编辑，具
体过程如下：1）把rev
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tad
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apobec1的dna序列构建到真核表达载体上，使其表达靶向rna的编辑酶，在同一载体把seq id no.13序列构建在u6或h1启动子后面，表达出指引rna；rev
‑
tad
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apobec1的dna序列如seq id no.12所示，具体如下：atgcccaagaagaagcgcaaggtggccggccgcagcggcgacagcgacgaggagctgatccgcaccgtgcgcctgatcaagctgctgtaccagagcaaccccccccccaaccccgagggcacccgccaggcccgccgcaaccgccgccgccgctggcgcgagcgccagcgccagatccacagcatcagcgagcgcatcctgggcacctacctgggccgcagcgccgagcccgtgcccctgcagctgccccccctggagcgcctgaccctggactgcaacgaggactgcggcaccagcggcacccagggcgtgggcagcccccagatcctggtggagagccccaccgtgctggagagcggcaccaaggagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggccgccgcgccttcatcaccggcgtgttctacctgagcgaggtggagttcagccacgagtactggatgcgccacgccctgaccctggccaagcgcgcctgggacgagcgcgaggtgcccgtgggcgccgtgctggtgcacaacaaccgcgtgatcggcgagggctggaaccgccccatcggccgccacgaccccaccgcccacgccgagatcatggccctgcgccagggcggcctggtgatgcagaactaccgcctgatcgacgccaccctgtacgtgaccctggagccctgcgtgatgtgcgccggcgccatgatccacagccgcatcggccgcgtggtgttcggcgcccgcgacgccaagaccggcgccgccggcagcctgatggacgtgctgcaccaccccggcatgaaccaccgcgtggagatcaccgagggcatcctggccgacgagtgcgccgccctgctgagcgacttcttccgcatgcgccgccaggagatcaaggcccagaagaaggcccagagcagcaccgacggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcatgagcagcgagaccggccccgtggccgtggaccccaccctgcgccgccgcatcgagccccacgagttcgaggtgttcttcgacccccgcgagctgcgcaaggagacctgcctgctgtacgagatcaactggggcggccgccacagcatctggcgccacaccagccagaacaccaacaagcacgtggaggtgaacttcatcgagaagttcaccaccgagcgctacttctgccccaacacccgctgcagcatcacctggttcctgagctggagcccctgcggcgagtgcagccgcgccatcaccgagttcctgagccgctacccccacgtgaccctgttcatctacatcgcccgcctgtaccaccacgccgacccccgcaaccgccagggcctgcgcgacctgatcagcagcggcgtgaccatccagatcatgaccgagcaggagagcggctactgctggcgcaacttcgtgaactacagccccagcaacgaggcccactggccccgctacccccacctgtgggtgcgcctgtacgtgctggagctgtactgcatcatcctgggcctgcccccctgcctgaacatcctgcgccgcaagcagccccagctgaccttcttcaccatcgccctgcagagctgccactaccagcgcctgcccccccacatcctgtgggccaccggcctgaagseq id no.13序列如下所示：aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctccaaattcaccatctgacatcatgt注：加粗标注的序列为与靶序列通过反向互补原则结合的序列；下划线标注序列为rev蛋白结合区。
17.2）把步骤1）所构建的重组载体转染至293t细胞中；3）再次培养24
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48小时，即可使ampkα亚基发生碱基改变。
18.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。