检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法与流程

1.本发明涉及细胞产品质量检测技术领域，尤其是指检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法。


背景技术：

2.细胞产品制备质量控制以及患者注射细胞产品后的随访，均要求检测外源病毒载体基因拷贝数，以监控细胞内外源病毒载体基因拷贝数的变化。出于安全性考虑，现行政策要求：细胞产品中的外源病毒载体基因拷贝数不高于5拷贝/细胞。对患者体内的外源car或tcr拷贝数进行间接追踪，有利于评估car-t或tcr-t细胞在体内的存活。
3.现时，国内外相关研究中，普遍使用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qpcr法)进行基因拷贝数的测定。qpcr法是一种灵敏度高、特异性强且可通过实时监控进行定量的核酸检测技术。qpcr法最常用的有两种技术：一种是荧光染料法，但其与dna亲和力强，通常对pcr反应有抑制作用；另一种是荧光探针法，为序列特异性的taqman探针，灵敏度高，特异性强，已经被应用于生物制药的一些领域。国外已有相关文献研究利用探针qpcr法，建立外源基因拷贝数的检测方法，但针对某一采用特定载体的细胞的检测方法并不适用于工作载体或类型不同的细胞的质量控制检测中，对应的引物选择也存在差异。使用qpcr法检测细胞拷贝数时，既要保证能检出目标载体拷贝数，又要屏除细胞本身的核酸序列干扰，所以，引物的选择影响检测结果的可靠性和准确性。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：设计用于检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物，保证检测结果的可靠性和准确性。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
6.检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针，引物由primer-f和primer-r组成，所述primer-f的序列示于seq id no：1，所述primer-r的序列示于seq id no：2，探针(probe)的序列示于seq id no：3；所述引物用于扩增病毒载体的部分序列和/或相应的互补序列，所述病毒载体的部分序列示于seq id no：4。
7.一种试剂盒，包含质粒标准品以及上述所述的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针。
8.进一步地，所述的试剂盒还包含premix ex taq、rox reference dyeⅱ和健康人基因组dna。
9.进一步地，所述的试剂盒还包含ultrapure water和孔板。
10.进一步地，所述primer-f的浓度为1～100μmol/l，所述primer-f的浓度为1～100μmol/l，所述探针的浓度为1～100μmol/l，所述质粒标准品的浓度为1
×
106～9
×
109copies/μl。
11.进一步地，所述primer-f的浓度为10μmol/l，所述primer-f的浓度为10μmol/l，所
述探针的浓度为10μmol/l，所述质粒标准品的浓度为9
×
107～2
×
108copies/μl的msgv1标准品。
12.一种检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，采用上述所述的试剂盒，以所述质粒标准品构建标准曲线，以所述引物和探针构建qpcr检测体系检测得到细胞基因组中病毒载体的拷贝数。
13.进一步地，所述qpcr检测体系包括标准曲线qpcr反应体系和样品qpcr反应体系；所述标准曲线qpcr反应体系由premix ex taq、primer-f、primer-r、探针、rox reference dyeⅱ、健康人基因组dna、ultrapure water和质粒标准品组成，所述样品qpcr反应体系由premix ex taq、primer-f、primer-r、探针、rox reference dyeⅱ、ultrapure water和样品组成。
14.进一步地，所述qpcr检测体系的反应程序为：在95
±
1℃的条件下预变性60
±
3s后，循环进行35-42个的pcr反应；所述pcr反应先在95
±
1℃的条件下反应4-7s，然后在在62
±
1℃的条件下反应30-38s。
15.进一步地，所述健康人基因组dna和所述样品均经过相同的样品处理过程处理；所述样品包括待测样品、阴性对照样品和质控样品；所述样品处理过程为样品dna的提取；所述质粒标准品为msgv1标准品。
16.本发明的有益效果在于：通过病毒载体将插入序列整合到细胞的基因组中，部分病毒载体元件序列(例如：示于seq id no：5的病毒载体元件)和/或相应的互补序列也会被整合到细胞的基因组中。通过所设计的引物和探针，扩增该部分病毒载体元件序列，能够特异性地检测出病毒载体拷贝数。引物和探针的特异性好，所作用的部分病毒载体元件序列与人基因组无相似性，投放引物和探针后，不会扩增任何除该部分病毒载体元件序列以外的序列，因而检测准确度高。此外，引物和探针在应用时，灵敏度高、精密度高。
附图说明
17.下面结合附图详述本发明的具体结构
18.图1为本发明的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法的实施例标准曲线图；
19.图2为本发明的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法的实施例扩增曲线图。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例
22.1材料
23.1.1样品
24.待测样品：细胞样品(car-t细胞)(该细胞样品是基于msgv1-1d3-28z.1-3mut载体
质粒，经过将插入基因1d3-28z.1-3mut去除，并插入car基因后制备的质粒，利用pg13细胞包装成病毒载体，然后再侵染患者t淋巴细胞，制成的细胞制剂。)
25.阴性对照细胞：活化未转导t细胞(nc-t细胞)
26.msgv1标准品(stock):108copies/μl
27.健康人基因组：100ng/μl
28.1.2试剂
29.(1)台盼蓝(trypan blue stain)(0.4％)，gibco；
30.(2)血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，天根生物；
31.(3)rnasea，天根生物，100mg/ml；
32.(4)quant-ittm picogreentm dsdnaassay kit，invitrogen；
33.(5)ultrapure dnase/rnase-free distilledwater(以下简称ultrapure water)，invitrogen；
34.(6)premix ex taq(probe qpcr)(taqman探针法预混型试剂)，takara；
35.(7)primer-f、primer-r、probe，生工生物。
36.3检验过程
37.3.1细胞样品处理
38.将car-t细胞和nc-t细胞轻轻吹打混匀后，进行细胞计数，测定细胞密度，取出所需要的细胞(≤5
×
106/管)，1500rpm离心3min，去上清，加入1ml1
×
pbs溶液，重悬细胞。
39.3.2细胞基因组dna(gdna)的提取
40.按照天根生物的《血液/组织/细胞基因组提取试剂盒》操作说明书提取car-t细胞基因组dna、nc-t细胞基因组dna。
41.3.3picogreen法精确测定细胞基因组dna的浓度
42.按照《quant-it
tm picogreen
tm dsdnaassay kit》试剂盒说明书精确测定car-t细胞基因组dna、nc-t细胞基因组dna的浓度。
43.3.4qpcr检测
44.3.4.1qpcr反应体系的配制
45.(1)将premix ex taq(probe qpcr)(2
×
conc.)、rox reference dye ii(50
×
conc.)、正反引物及探针(均为10μm)、健康人基因组dna放4℃冰箱避光解冻。
46.(2)标准品的反应体系按照表1配制：
47.表1标准曲线qpcr反应体系配制
48.[0049][0050]
注：#实际添加的是采用msgv1标准品稀释后的各个梯度浓度的稀释液，详见表3。
[0051]
(3)样品的反应体系按照表2配制：
[0052]
表2样品的qpcr反应体系配制
[0053][0054]
注：同一反应孔中，*样品包括待测样品、阴性对照样品和质控样品，待测样品为car-t细胞基因组dna、阴性对照样品为nc-t细胞基因组dna、质控样品为加标nc-t细胞基因组dna。nc-t细胞为患者t细胞，nc-t细胞对应的dna称为nc-t细胞基因组dna。
[0055]
3.4.2样品的稀释
[0056]
使用ultrapure water将car-t细胞基因组dna和nc-t细胞基因组dna稀释为10ng/μl，稀释液体积不少于20μl。侧壁轻弹3次后放至微型离心机离心3秒，放常温待用。
[0057]
3.4.3标准曲线用msgv1标准品的各个梯度浓度按照表3配制：
[0058]
表3msgv1标准品梯度稀释表
[0059][0060]
3.4.4质控样品用标准品溶液的配制：
[0061]
质控样品：样品采用加标nc-t细胞基因组dna时，该孔的反应体系为质控样品。加标nc-t细胞基因组dna的配制方法为：在nc-t细胞基因组样品中加入已知浓度的msgv1标准品——本实施例中，反应孔中存在50ng的nc-t细胞基因组dna和2500拷贝的msgv1标准品。
[0062]
3.4.5上机检测
[0063]
(1)设置靶点：靶点名称为“msgv”，报告荧光基团为“fam”，猝灭荧光基团为“nfq-mgb”，检测参比荧光为“rox”。
[0064]
(2)设置样品：根据实际设置样品名称。
[0065]
(3)输入板布局：根据实际点板情况填入板布局，系列标准品的孔设置为“s”孔，填入系列标准品的上样拷贝数。无模板阴性对照孔(ntc)设置为“n”，检测样品孔设置为“u”。
[0066]
(4)按照表4设置反应程序：
[0067]
表4qpcr反应程序
[0068][0069]
3.4.6结果分析
[0070]
打开保存的文件，点击分析按钮(analyze)，数据分析后导出excel表。具体结果详见表5、图1以及图2。
[0071]
表5待测样品msgv1载体拷贝数检测结果
[0072][0073]
3.4.7待测样品外源msgv1病毒载体拷贝数的计算
[0074]
(1)上样car-t细胞数计算：
[0075]
每个细胞所含健康人基因组质量为6.6pg，待测样品的实际上样基因组质量为m，因此上样细胞数为：
[0076]
由于待测样品为10ng/μl的car-t基因组，共5μl，因此上样细胞数为：
[0077][0078]
(2)单个细胞的外源病毒载体基因平均拷贝数计算：
[0079][0080]
其中，c为待测样品的外源病毒载体基因拷贝数。
[0081]
3.4.8结果判定
[0082]
3.4.8.1该实验结果同时满足以下条件，则实验结果方有效：
[0083]
(1)标准曲线相关系数r2应≥0.99，扩增效率应介于90％～110％之间；
[0084]
(2)无模板阴性对照(ntc)的ct值应为undetermined；
[0085]
(3)阴性对照(ncs)的ct值应为undetermined；
[0086]
(4)同一浓度标准曲线点、质控样品和同一待测样品的复孔ct值之间的标准偏差应≤0.5；
[0087]
(5)质控样品的回收率应介于70％～130％之间；
[0088]
3.4.8.2待测样品的外源病毒载体基因平均拷贝数≤5copies/cell，则判定该批次细胞注射液外源病毒载体基因拷贝数检测合格。否则，判定不合格。
[0089]
上述实施例方法的可行性验证：
[0090]
将所设计的primer-f、primer-r、probe送上海生工生物有限公司合成，具体情况详见表6。获得引物或探针后，使用ultrapure water溶解引物或探针为10μmol/l溶液，分装至pcr管，-20℃冻存。
[0091]
表6探针和引物特征表
[0092][0093][0094]
注：产物的序列示于seq id no：4。
[0095]
(1)引物特异性验证：
[0096]
因car-t细胞本身和msgv1病毒载体中含有pg13细胞残留dna可能与msgv1病毒载体引物同源，因此设置检测样本为：水(ntc)、健康人pbmc基因组dna、nc-t细胞基因组dna、pg13细胞基因组dna。同时设置阳性对照样本：pmsgv质粒(基于msgv1-1d3-28z.1-3mut载体质粒，经过将插入基因1d3-28z.1-3mut去除，并插入tcr基因后制备的质粒)。
[0097]
将上述样本按实施例所示方法进行荧光定量pcr检测。结果如表7所示。
[0098]
表7特异性验证试验检测结果
[0099][0100]
根据表7结果可知，除了阳性对照样本，其余样本均未检出，说明本发明提供的引物和探针不会在这些样本中发生非特异性反应。因此，本发明检测细胞基因组中病毒载体
拷贝数检测试剂盒中的引物具有良好的特异性。
[0101]
(2)灵敏度试验：
[0102]
根据表3，将msgv1标准品(stock)用ultrapure water稀释成一系列浓度梯度样品：500000拷贝/反应、50000拷贝/反应、5000拷贝/反应、500拷贝/反应、50拷贝/反应，5拷贝/反应，分别标记为：st1、st2、st3、st4、st5、st6，所得的实施例标准曲线图详见图1，所得的实施例扩增曲线图详见图2。从图2的扩增曲线图中可知：扩增曲线有明显的指数增长期；从图1的标准曲线图中可知：线性方程为y＝-3.214lgx+35.915，即加入msgv1标准品的每个反应孔中，在5拷贝至500000拷贝之间呈良好的线性关系，ct值与dna模板量的lg值呈良好的线性关系，r2为1.000，扩增效率介于90％～110％之间，检测灵敏度可达5拷贝/反应。
[0103]
重复三次试验，结果详见表8。从表8中可看出，额外三次实验结果的标准曲线，在dna模板量5拷贝/反应至500000拷贝/反应之间的线性很好，r2均在0.99以上，扩增效率介于90％～110％之间，所以，本技术的方法对tcr-t细胞dna的定量限loq可达5拷贝/反应，即1copies/μl。
[0104]
表8灵敏度试验标准曲线重复实验结果
[0105]
实验线性方程线性判定系数r2扩增效率％重复1y＝-3.292lgx+36.3640.999101.264重复2y＝-3.327lgx+36.1710.99999.801重复3y＝-3.358lgx+36.8670.99898.496
[0106]
(3)准确度验证：
[0107]
在实施例的方法基础上，准确度分析采用加标回收的方法进行：往三批次nc-t细胞基因组dna中加入的msgv1标准品配制为：nc-t细胞基因组dna50ng/反应和对应高中低浓度(375000拷贝/反应，50000拷贝/反应和300拷贝/反应)的标准品，每个浓度3个复孔，由三名不同实验人员(chy、wjt、lqq)进行相同检验操作，准确度(回收率)结果见表9。
[0108]
表9准确度试验回收率计算结果
[0109][0110][0111]
根据表9结果可知，在三次实验中，三批次nc-t细胞样品的高中低浓度加标回收率
均介于80％～120％之间，本发明的试剂盒及检测方法的准确度验证符合标准要求。
[0112]
(4)精密度验证：
[0113]
由三个不同实验人员对三个批次的car-t细胞样品进行检测。
[0114]
表10批内和批间精密度计算结果
[0115][0116]
根据表10结果可知，在三次实验中，三批次nc-t细胞样品的检测值的批内变异系数不超过20％、批间变异系数不超过25％。因此，本发明提供的试剂盒和检测方法的精密度验证符合标准要求。
[0117]
综上所述，本发明提供的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒和方法中，引物和探针在应用时，检测的特异性好、准确度高、灵敏度高、精密度高，且定量限loq可达1copies/μl。故，本发明提供的试剂盒和检测方法的符合检测标准要求。
[0118]
msgv1标准品制备
[0119]
上述实施例和实验时所用的msgv1标准品(stock)由以下方法制备得到：
[0120]
1试剂
[0121]
(1)msgv1-1d3-28z.1-3mut载体质粒(以下简称msgv1质粒)，addgene，#107227；
[0122]
(2)sali-hf，neb，
[0123]
(3)rsap(重组虾碱性磷酸酶)，neb；
[0124]
(4)e.z.n.a gel extractionkit，omega；
[0125]
(5)ultrapure dnase/rnase-free distilledwater(以下简称ultrapure water)，invitrogen；
[0126]
(6)quant-it
tm
dsdnaassay kit，invitrogen；
[0127]
(7)其它试剂：
[0128]
琼脂糖，50
×
tae dnaelectrophoresis buffer，核酸染料，6
×
loading buffer，dl5000 marker。
[0129]
2标准品的制备过程
[0130]
标准曲线的标准品为msgv1质粒的线性化产物，制备流程为：(1)酶切；(2)去磷酸化；(3)去磷酸化后产物的纯化；(4)picogreen法精确测定胶回收产物的浓度；(5)msgv1标准品拷贝数浓度的计算；(6)msgv1标准品的储存。
[0131]
各步骤详细流程为：
[0132]
2.1酶切
[0133]
使用sali-hf对msgv1质粒进行单酶切。具体酶切反应体系详见表11，具体反应程
序为：37℃，60min。
[0134]
表11 msgv1质粒单酶切反应体系
[0135][0136]
2.2去磷酸化
[0137]
使用重组虾碱性磷酸酶(rsap)对msgv1质粒的线性化产物进行去磷酸化，降低产物自连。
[0138]
(1)操作：往第2.1步反应完毕的酶切体系内直接加入2μl rsap，短暂离心混匀，然后按照以下反应程序进行反应：
[0139]
(2)反应程序：37℃，60min；65℃，5min。反应结束后，将反应产物放4℃保存。
[0140]
2.3去磷酸化后产物的纯化
[0141]
2.3.1琼脂糖凝胶电泳：
[0142]
(1)1％浓度的琼脂糖凝胶的配制：用量筒取100ml 1
×
tae缓冲液至三角瓶中，称取1g琼脂糖，加入至盛有1
×
tae缓冲液的三角瓶中，混匀，将溶液放置于微波炉中加热2～3min直至琼脂糖完全溶解后，在溶液中加入1.5μl gelred核酸染料，轻轻摇晃瓶子至染料充分混匀后，将梳子插入到凝胶槽中，将溶液倒至凝胶槽中，静置40min以上，直到凝胶充分凝固，凝胶凝固后拔出梳子。
[0143]
(2)电泳：向电泳槽中倒入1
×
tae缓冲液，缓冲液的量以没过凝胶为宜，然后将凝胶放入电泳槽中，取50μl产物加入10μl 6
×
loading buffer，将其充分混匀后点入凝胶孔中，取5μl dl5000 marker点入凝胶孔中，进行电泳，电泳条件：100v，35min。
[0144]
2.3.2凝胶回收目的基因：
[0145]
使用按照omega的gel extraction kit说明进行凝胶回收，提取目标条带。
[0146]
2.4 picogreen法精确测定胶回收产物的浓度：
[0147]
按照《quant-it
tm picogreen
tm dsdnaassay kit》(invitrogen，p11496)试剂盒说明书，精确测定胶回收产物的浓度。
[0148]
2.5 msgv1标准品拷贝数浓度的计算
[0149]
将精确定量后的msgv1胶回收产物定义为msgv1标准品，已知msgv1全长6941bp，按照下式计算msgv1标准品的拷贝数浓度：
[0150][0151]
其中：
[0152]
·
c为msgv1标准品通过picogreen精确定量的msgv1胶回收产物的浓度；
[0153]
·
6.02
×
10
23
为阿伏伽德罗常数；
[0154]
·
660g/(mol
·
bp)为双链dna每碱基对的平均分子质量；
[0155]
2.6 msgv1标准品的储存
[0156]
采用picogreen法精确定量地将msgv1标准品(stock)的拷贝数浓度稀释为108copies/μl，充分吹打混匀后，分装到0.2ml pcr管中，10μl/管，于-80℃冰箱保存。
[0157]
本发明实施例所用健康人基因组dna制备方法与待测样品基因组dna的制备相同，制备浓度为100ng/μl，-80℃冰箱保存。
[0158]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。