外周血单个核细胞的培养液及培养方法与流程

1.本发明属于细胞培养技术领域，更具体为pbmc培养液及培养方法。


背景技术：

2.诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,ipscs)是利用重编程技术获得的与胚胎干细胞功能类似的细胞。它具有分化为三胚层在内的所有细胞类型的潜能，是目前干细胞与组织再生研究领域的一项重大突破，因其解决了胚胎干细胞来源有限和伦理学障碍的难题，在医学领域展示了广阔的应用前景。目前，人ipsc细胞主要自皮肤成纤维细胞重编程而来，而从皮肤中取样面临着组织活检时间长，取材不方便，患者疼痛感强且有被细菌感染等风险，获取的细胞需要体外扩增到足量的成纤维细胞才能进行ipsc诱导，耗时较长。2010年，科学家从外周血细胞中诱导出ipsc，这项技术的出现为ipsc研究领域带来一次质的飞跃。相对于皮肤成纤维细胞，外周血取材方便，来源丰富，是一种理想的ipsc供体细胞，具有广泛的应用前景。
3.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)，指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量祖细胞(如造血干细胞等)。目前最常用分离外周血单个核细胞的方法为ficoll密度梯度离心法，该方法得到的细胞纯度较好，红细胞比例少。外周血中分离出来的单个核细胞一般在体外采用fbs或含有动物来源的组份(如bsa)进行培养，此类pbmc培养液扩增培养的效率较差，细胞活性不高，且不利于临床应用。
4.因此，要使pbmc重编程为人诱导性多能干细胞得到广泛应用，必须开发一种无血清、无动物源成份的pbmc培养液，其能够快速高效地扩增pbmc，同时具有较高的重编程效率。


技术实现要素：

5.本发明提供外周血单个核细胞(pbmc)培养液以及培养方法，可以在较好地维持pbmc细胞的群体特性的同时大大提高pbmc细胞培养和诱导干细胞重编程效率。
6.本发明一方面提供外周血单个核细胞(pbmc)培养液，所述培养液包括：基础培养基dmem/f12和血细胞培养基stempro
‑
34，以及细胞生长因子、l
‑
抗坏血酸、β
‑
疏基乙醇、亚硝酸钠、乙醇胺、rock抑制剂、人血清白蛋白、转铁蛋白、肝素钠和ahr抑制剂。
7.在一些实施方案中，所述rock抑制剂为thiazovivin、y
‑
27632或kd
‑
025；更优选地，所述rock抑制剂的浓度为1
‑
10μm/ml，更优选为5μm/ml。
8.在一些实施方案中，所述ahr抑制剂为sr1、pd98059、ch
‑
223191、ahr antagonist 2、ahr antagonist 4、gnf351或pdm2；更优选地，所述ahr抑制剂浓度为0.5
‑
5μm/ml，更优选为2μm/ml。
9.在一些实施方案中，所述培养液进一步包括去乙酰化酶抑制剂。
10.在一些实施方案中，所述去乙酰化酶抑制剂为vpa、nabu、tsa或saha；更优选地，所
述去乙酰化酶抑制剂浓度为0.5
‑
5μm/ml，更优选为2μm/ml。
11.在一些实施方案中，所述培养液进一步包括gsk
‑
3抑制剂。
12.在一些实施方案中，所述gsk
‑
3抑制剂为chir99021、sb 216763、tws119、ly2090314、tideglusib或小分子化合物bio；更优选地，所述gsk
‑
3抑制剂浓度为0.1
‑
1μm/ml，更优选为0.5μm/ml。
13.在一些实施方案中，所述培养液中包含的细胞生长因子包括所述的细胞生长因子包括scf、igf
‑
1、flt
‑
3l、tpo、epo和gm
‑
csf。
14.在一些实施方案中，所述培养液中生长因子scf的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为10
‑
50ng/ml，更优选为25ng/ml。
15.在一些实施方案中，所述培养液中生长因子igf
‑
1的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为10
‑
50ng/ml，更优选为25ng/ml。
16.在一些实施方案中，所述培养液中生长因子flt
‑
3l的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为10
‑
50ng/ml，更优选为20ng/ml。
17.在一些实施方案中，所述培养液中生长因子tpo的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为10
‑
50ng/ml，更优选为25ng/ml。
18.在一些实施方案中，所述培养液中生长因子epo的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为10
‑
50ng/ml，更优选为30ng/ml。
19.在一些实施方案中，所述培养液中生长因子gm
‑
csf的浓度为10
‑
100ng/ml，优选为10
‑
50ng/ml，更优选为25ng/ml。
20.在一些实施方案中，所述培养液中l
‑
抗坏血酸浓度为100μm
‑
1mm/ml，优选为500μm/ml。
21.在一些实施方案中，所述培养液中β
‑
疏基乙醇浓度为1
‑
10μm/ml，优选为5μm/ml。
22.在一些实施方案中，所述培养液中亚硝酸钠浓度为1
‑
10μm/ml，优选为5μm/ml。
23.在一些实施方案中，所述培养液中乙醇胺浓度为1
‑
10μm/ml，优选为5μm/ml。
24.在一些实施方案中，所述培养液中人血清白蛋白浓度为5
‑
50g/l，优选为10g/l。
25.在一些实施方案中，所述培养液中转铁蛋白浓度为50
‑
500μg/ml，优选为75μg/ml。
26.在一些实施方案中，所述培养液中肝素钠浓度为50
‑
500μg/ml，优选为250μg/ml。
27.在一些实施方案中，所述培养液中dmem/f12培养基和血细胞培养基stempro
‑
34的体积比为1：0.9
‑
1.3。
28.本发明的另一方面提供外周血单个核细胞(pbmc)的培养方法，所述方法包括在前述的培养液中培养外周血单个核细胞。
29.在一些实施方案中，所述方法包括下述步骤：
30.步骤1)将外周血单个核细胞(pbmc)按照0.005
‑
0.05
×
106细胞/孔接种于细胞培养容器中；用权利1
‑
8任一项所述的pbmc培养液对接种于细胞培养容器中的细胞进行培养，于35～39℃、3～7％co2培养3
‑
5天；培养期间每1
‑
3天更换一次培养液；
31.步骤2)待细胞密度长至80％
‑
100％时，传代至新的细胞培养容器中，传代比例为1:3
‑
1:10；用权利1
‑
8任一项所述外周血单个核细胞培养液继续于35～39℃优选37℃、3～7％co2，培养2
‑
5天，优选3天。
32.在一些实施方案中，步骤1)中接种细胞密度为0.015
×
106细胞/孔。
33.在一些实施方案中，步骤1)中培养温度为37℃。
34.在一些实施方案中，步骤1)中在5％co2条件下培养pbmc。
35.在一些实施方案中，步骤1)中对pbmc细胞培养4天。
36.在一些实施方案中，步骤1)中每隔2天更换一次培养液。
37.在一些实施方案中，步骤2)中细胞传代比例为1：5。
38.在一些实施方案中，步骤2)中培养温度为37℃。
39.在一些实施方案中，步骤2)中在5％co2条件下培养pbmc。
40.在一些实施方案中，步骤2)中对pbmc细胞培养3天。
41.在一些实施方案中，所述细胞培养容器可以是多孔板。
42.本发明的另一方面提供前述pbmc培养液在培养外周血单个核细胞中的应用。
43.在一些实施方案中，所述培养是扩增外周血单个核细胞，即促使外周血单个核细胞增殖，增加其数量。
44.在一些实施方案中，本发明所培养的外周血单个核细胞用于重编程为诱导多能干细胞(ipsc)。
45.本发明所述的“外周血单个核细胞(pbmc)”是指从外周血分离的单个核细胞，主要包括淋巴细胞，也包括少数单核细胞、浆细胞、造血干细胞和其他祖细胞等，通常可以是从冻存或新鲜采集的血液样本用ficoll
‑
paque密度梯度离心法分离获得。
46.本发明所述的“基础培养基dmem/f12(dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture f
‑
12)”是dmem和ham's f
‑
12的1:1混合物，是一种广泛使用的基础培养基，可用于支持多种哺乳动物细胞生长，可以从多个供应商(例如thermo fisher scientific)购买获得。
47.本发明所述的“血细胞培养基stempro
‑
34”是一种无血清培养基，可以从多个供应商(例如gibco，
‑
34sfm)购买获得。
48.本发明所述的“细胞生长因子”是指可以促进细胞存活、生长和/或体外扩增的细胞因子，包括但不限于scf、igf
‑
1、flt
‑
3l、tpo、epo和gm
‑
csf。其中scf是干细胞因子(stem cell factor)，igf
‑
1是胰岛素样生长因子
‑
1(insulin growth factor
‑
1)，flt
‑
3l是fms相关的酪氨酸激酶3配体(fms
‑
related tyrosine kinase 3ligand)，tpo是血小板生成素(thrombopoietin，也叫血小板生长因子)，epo是红细胞生成素(erythropoietin，也叫红细胞生长因子)，gm
‑
csf是粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte
‑
macrophage colony
‑
stimulating factor)。所述细胞生长因子中的一种或多种可以是来源于人的和/或重组生产的。所述细胞生长因子可以从多个供应商购买获得。
49.本发明所述的“rock抑制剂”是指rho相关蛋白激酶(rho
‑
associated protein kinase,rock)的抑制剂，包括但不限于thiazovivin、y
‑
27632和kd
‑
025(也称slx
‑
2119)。本发明的培养液中可以包括一种或更多种rock抑制剂。
50.本发明所述的“ahr抑制剂”是指芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，ahr)的抑制剂，包括但不限于sr1(stemregenin
‑
1)、pd98059、ch
‑
223191、ahr antagonist2(例如可参见wo2019101641a1，compound example 1，cas no.:2338747
‑
54
‑
7)、ahr antagonist 4(例如可参见wo2018146010a1，example 293，cas no.:2242465
‑
58
‑
1)、gnf351和pdm2。本发明的培养液中可以包括一种或更多种ahr抑制剂。
51.本发明所述的“去乙酰化酶抑制剂”也可以被称为组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，hdaci)，是能够抑制组蛋白去乙酰化酶(hdac)活性的试剂，包括但不限于vpa(丙戊酸，valproic acid)、nabu(丁酸钠，sodium butyrate)、tsa(曲古菌素，trichostatin a)和saha(辛二酰苯胺异羟肟酸，suberoylanilide hydroxamic acid)。本发明的培养液中可以包括一种或更多种去乙酰化酶抑制剂。
52.本发明所述的“gsk
‑
3抑制剂”是指糖原合成酶激酶
‑
3(glycogen synthase kinase
‑
3)的抑制剂，包括但不限于chir99021、sb 216763、tws119、ly2090314、tideglusib和小分子化合物bio(6
‑
溴靛玉红
‑3‑
肟，6
‑
bromoindirubin
‑3‑
oxime)。本发明的培养液中可以包括一种或更多种gsk
‑
3抑制剂。本发明中的rock抑制剂、ahr抑制剂、去乙酰化酶抑制剂和gsk
‑
3抑制剂均可以从多个供应商购买获得。
53.本发明的培养液中的各组分可协同快速活化体外提取的外周血细胞，提高外周血单个核细胞(pbmc)扩增培养效率。其中dmem/f12和血细胞培养基stempro
‑
34，作为无血清的基础培养基能够为细胞生长增殖提供丰富的营养来源，而且能够维持pbmc的表型特征和细胞活性。l
‑
抗坏血酸和β
‑
疏基乙醇具有较强的还原性，能中和细胞培养过程中培养基中积累的氧自由基，促进细胞的生长增殖。人血清白蛋白，转铁蛋白和乙醇胺能够在无血清培养基中为细胞提供充足的营养供应。肝素钠的抗凝效果可以更好地维持pbmc的活性，有利于后续细胞的重编程。ahr抑制剂(如sr1、pd98059、ch
‑
223191、ahr antagonist 2、ahr antagonist 4、gnf351或pdm2)具有促进pbmc生长，促进cd34+细胞增殖，降低ventx表达水平，维持细胞表型功能。去乙酰化酶抑制剂(如vpa、nabu、tsa或saha)可以在体外培养时促进造血干细胞的扩增，并且可以通过调控染色质开放结构程度提高培养液中其他细胞因子如scf、igf
‑
1对细胞的作用强度。gsk
‑
3抑制剂(如chir99021、sb 216763、tws119、ly2090314、tideglusib或小分子化合物bio)可以抑制细胞凋亡，从而促进细胞的增殖，提高细胞的扩增效率。rock抑制剂(如thiazovivin、y
‑
27632或kd
‑
025)可以增加细胞
‑
ecm粘附介导的β1整合蛋白活性，通过与其他生长因子协同促进细胞存活，促进pbmc细胞的体外扩增。细胞因子scf、gm
‑
csf、tpo的协同作用，可以促进细胞在体外的扩增，不断产生大量的外周血细胞。epo、igf
‑
1、flt
‑
3l不仅可以促进细胞生长，提高pbmc细胞在体外的扩增效率，而且具有保护细胞作用。
54.用本发明的培养液培养的pbmc细胞可用于重编程诱导产生诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell)，例如可以将用本发明的培养液培养的pbmc细胞用诱导多能干细胞培养液进行培养并添加重编程因子(例如oct
‑
4，klf
‑
4和c
‑
myc转录因子，例如可以用携带这些转录因子的质粒染到所述pbmc细胞，优选地，各质粒dna的转染量分别为oct
‑
4：klf
‑
4：c
‑
myc＝1:1:1)，随后用重编程诱导培养液进行培养。
55.本发明所述的pbmc培养液以dmem/f12培养基和血细胞培养基stempro
‑
34为基础，添加了ahr抑制剂、乙酰化酶抑制剂、gsk
‑
3抑制剂和rock抑制剂以及scf、igf
‑
1、flt
‑
3l、tpo、epo、gm
‑
csf等细胞因子的组合，可以在体外协同作用，促进外周血单个核细胞的快速增殖，在体外高效扩增的同时维持其细胞特性，为后续ipsc细胞重编程提供充足的细胞来源。经所述方法，可以让pbmc细胞在短时间内快速扩增，达到细胞重编程所需数量，而且能够高效地进行ipsc细胞重编程，与现有技术相比，大大提高了pbmc细胞在体外的扩增效率，节约了时间和成本。
56.本文所用术语“包含”、“含有”、“具有”以及类似的表述表示不排除未列举的要素且还可以包含其它未列举的要素，也包括仅由所列举的要素组成的情形。
附图说明
57.图1为不同培养液获得的pbmc显微镜照片；
58.图2为不同培养液获得的pbmc数量；
59.图3为不同培养液获得的pbmc活性；
60.图4为不同培养液获得的pbmc重编程后出克隆情况；
实施例
61.下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
62.实施例1不同培养液成分对pbmc增殖速率的影响
63.实施步骤：将冻存或新鲜采集的血液样本用ficoll
‑
paque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(pbmc)，按照0.015
×
106细胞/孔密度接种于12孔板中，按各实验组设计的pbmc培养液对接种于12孔板中的细胞于37℃、5％co2培养4天，培养期间每2天更换一次培养液，移除未贴壁的细胞，消化后统计各实验组细胞数量。
64.各实验组培养液设计如下，其中：
65.对照pbmc培养液成分为基础培养基
‑
34sfm(购自gibco，货号10639
‑
011)，添加il
‑
3浓度为20ng/ml，il
‑
6浓度为20ng/ml，scf浓度为100ng/ml和fl
‑
3浓度为100ng/ml。
66.实验培养液基础成分为体积比为1:1的dmem/f12培养基和stempro
‑
34，添加生长因子scf浓度为25ng/ml、igf
‑
1浓度为25ng/ml、flt
‑
3l浓度为20ng/ml、tpo浓度为25ng/ml、epo浓度为30ng/ml、gm
‑
csf浓度为25ng/ml，l
‑
抗坏血酸浓度为500μm/ml，β
‑
疏基乙醇浓度为5μm/ml，亚硝酸钠浓度为5μm/ml，乙醇胺浓度为5μm/ml，人血清白蛋白浓度为10g/l，转铁蛋白浓度为75μg/ml。
[0067][0068]
图1a
‑
d为采用不同培养液培养pbmc后获得的细胞明场照片。图2为采用不同培养液培养pbmc后获得的细胞数量。由图1和图2可知，对比实验组1和2，在基础培养成分上添加
肝素钠，rock抑制剂和ahr抑制剂，较采用对照培养液培养pbmc获得的细胞数量多；在实验组2成分基础上继续添加去乙酰化酶抑制剂vpa，细胞数量进一步增加，这可能与vpa间接调控培养液中其他细胞因子如scf、igf
‑
1对细胞的作用强度有关；实验组4是在实验组3培养液成分基础上进一步添加gsk
‑
3抑制剂chir99021，pbmc数量明显增加，所获细胞数量最多，说明gsk
‑
3抑制剂对pbmc增殖有显著影响。结果表明实验组2
‑
4培养液中各信号通路控制成分均能有效促进pbmc增殖，相对于实验组1的培养液成分能显著提高pbm的扩增效率，可用于pbmc扩增。
[0069]
实施例2培养液成分对pbmc活性的影响
[0070]
各实验组设计及实施步骤同实施例1，再采用计数仪对不同实验组获得的细胞活率进行统计。
[0071]
图3为采用不同培养液培养pbmc后获得的细胞活率。对比实验组2、3、4，发现随着培养液中成分肝素钠、rock抑制剂、ahr抑制剂，去乙酰化酶抑制剂和gsk
‑
3抑制剂的逐步添加，细胞活率亦增加，说明肝素钠，rock抑制剂，ahr抑制剂，去乙酰化酶抑制剂和gsk
‑
3抑制剂能很好地维持细胞代谢需求，抑制细胞凋亡，增加细胞活率。相比于实验组1，实验组2
‑
4的培养液采用dmem/f12培养基和stempro
‑
34，添加scf、igf
‑
1、flt
‑
3l、tpo、epo、gm
‑
csf细胞因子，以及ahr抑制剂、乙酰化酶抑制剂、gsk
‑
3抑制剂和/或rock抑制剂的组合，显著提高了细胞活率，表明所述培养液成分的有效性，所述培养液可用于维持pbmc活性。
[0072]
实施例3不同培养液获得的pbmc重编程后获得的克隆数
[0073]
具体实施步骤为：将冻存或新鲜采集的血液样本用ficoll
‑
paque密度梯度离心法分离pbmc，接种于12孔板中，用实施例1中各实验组所述pbmc培养液对接种于12孔板中的细胞于37℃、5％co2培养4天，每两天换一次液，待细胞密度长至80
‑
100％时，对其进行传代至新的12孔板中，传代比例为1：5，用各实验组对应的pbmc培养液继续于37℃、5％co2培养3天；取培养的pbmc细胞0.03
×
106进行重编程实验。将携带oct
‑
4，klf
‑
4和c
‑
myc转录因子的质粒通过电转染到人类外周血单个核细胞，各质粒dna的转染含量分别为oct
‑
4：klf
‑
4：c
‑
myc＝1:1:1；转染后day0
‑
day2阶段用实施例1中四个实验组的pbmc培养液对细胞进行隔天换液培养，转染后day3
‑
day5阶段用电转重编程诱导培养液eseential 6
tm
(thermofisher)对细胞隔天半换液；转染后day5
‑
day10阶段用电转重编程诱导培养液对细胞隔天全换液；转染后day10
‑
day15即可出现克隆，对各实验组获得的克隆数进行统计。
[0074]
图4为采用不同培养液获得的克隆数统计情况。由图可知，相同培养条件下采用不同培养液获得的克隆数量，实验组1采用对照培养液获得的细胞数量最少，为10个左右，使用依次添加信号通路控制剂的实验组2
‑
4的培养液培养后，出的克隆数量也逐渐增加，说明各信号通路控制剂均能有效发挥作用。实验组2
‑
4培养液成分获得的细胞数量增多，说明这些培养液成分有效，在体外高效扩增pbmc的同时维持了pbmc细胞特性，为后续ipsc细胞重编程提供充足的细胞来源。
[0075]
综上，本发明所述的pbmc培养液创新性地添加了ahr抑制剂、mek抑制剂、gsk
‑
3抑制剂和/或rock抑制剂等小分子抑制剂以及scf、igf
‑
1、flt
‑
3l、tpo、epo、gm
‑
csf的细胞因子的组合，可以在体外协同作用，显著提高外周血中造血干细胞和祖细胞的增殖，从而让pbmc细胞在短时间内快速扩增，达到细胞重编程所需数量，高效地进行ipsc细胞重编程，可应用于疾病机制研究、药物筛选、细胞治疗等方向。