一种抑制或杀灭东方黏虫的方法及其应用与流程

1.本发明涉及抗虫基因领域，具体而言，涉及一种抑制或杀灭东方黏虫的方法及其应用。


背景技术：

2.目前，农业生产上面临的生物胁迫(如病害和虫害等)和非生物胁迫(如旱害、寒害和盐害等)造成农作物生长势减弱，产量降低，给全球粮食安全造成巨大威胁。其中，虫害是影响农林生产力的主要生物胁迫因素之一。例如，东方黏虫(mythinmaseparata)又名行军虫、剃枝虫，是中国重大农作物病虫之一，主要危害小麦、水稻、玉米、高粱、糜子等禾谷类作物，有报道称东方黏虫已经成为我国危害最为严重的玉米害虫。因此，开发有效针对东方黏虫的防控方法具有重要意义。
3.随着使用化学农药进行害虫防治造成的环境问题愈发严重，生物杀虫剂的使用逐渐进入人们的视野。苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，简称bt)是一种革兰氏阳性菌，能够产生杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，icps)和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，vips)等不同类型的杀虫蛋白。其中，cry蛋白是在芽胞形成期于芽胞内形成的一类杀虫晶体蛋白，对大多数鳞翅目害虫具有良好抗性。
4.在中国专利cn201980049875.1中证明cry1b.868和cry1da_7基因共表达可表现出对鳞翅目害虫秋夜蛾、玉米穗蛾、西南玉米蛀虫和甘蔗蛀虫的抗性。然而，目前还未见通过cry1b.868蛋白控制东方黏虫的相关报道。
5.有鉴于此，特提供本发明。


技术实现要素：

6.本发明提供一种抑制或杀灭东方黏虫的方法和检测植物基因组dna是否插入cry1b.868基因的方法。
7.在第一方面，本发明提供一种抑制或杀灭东方黏虫的方法，所述方法包括：(1)提供基因组插入编码seq id no:2所示cry1b.868蛋白的基因的植物，所述植物表达cry1b.868蛋白，产生东方黏虫抗性；和(2)所述植物与东方黏虫接触，抑制或杀灭所述东方黏虫。
8.在一些具体的实施方式中，所述表达cry1b.868蛋白的基因具有如seq id no:1所示核苷酸序列。
9.在一些具体的实施方式中，所述植物为玉米、小麦、水稻或高粱。
10.在一些具体的实施方式中，所述表达cry1b.868蛋白的基因以单拷贝插入所述植物的基因组。
11.在一些具体的实施方式中，所述植物的cry1b.868蛋白表达量为3～4μg/g叶片。
12.在第二方面，本发明还提供一种检测植物基因组是否插入cry1b.868基因的方法，取植物样本的基因组dna进行pcr反应，根据pcr结果判断所基因组dna是否插入cry1b.868
基因；其中pcr反应使用具有如seq id no:7和seq id no:8所示序列的引物对，或使用seq id no:9和seq id no:10所示序列的引物对和seq id no:11所示的探针。
13.在一些具体的实施方式中，所述cry1b.868基因表达如seq id no:2所示的氨基酸序列。
14.在一些具体的实施方式中，所述cry1b.868基因具有如seq id no:1所示核苷酸序列。
15.术语定义
16.如本文所用，术语“重组”是指通常不会在自然界中发现并由人为干预产生的非天然dna、蛋白质或生物体。“重组dna分子”是这样的dna分子，其包含不会天然地一起出现并且是人为干预的结果的dna分子的组合。例如，由至少两个彼此异源的dna分子的组合构成的dna分子是重组dna分子，所述至少两个dna分子是诸如包含转基因和与该转基因相邻的植物基因组dna的dna分子。
17.本文所指的术语“dna”是指脱氧核糖核酸(dna)分子。dna分子可以是基因组或合成来源的，并且按照惯例是从5'(上游)端到3'(下游)端。如本文所用，术语“dna序列”是指dna分子的核苷酸序列。按照惯例，本发明的dna序列及其片段根据两条互补dna序列链中的仅一条链来公开。通过暗示和意图，此处提供的序列的互补序列(互补链的序列)在本领域中也称为反向互补序列，它们在本发明的范围内，并且明确地意在要求保护的主题的范围内。
18.本文所述的术语“pcr”，是一种需要2个位于待合成靶序列两侧的引物的体外dna扩增方法。引物是一段寡核苷酸序列，其能够以序列特异性的方式杂交到靶序列上并在pcr过程中延伸。扩增子(amplicons)或pcr产物或pcr片段是包括引物和新合成的靶序列拷贝的延伸产物。多重pcr系统含有多套引物，其导致同时产生多个扩增子。引物可与靶序列完全匹配或者它们可含有内部错配的碱基，该碱基可导致在特异的靶序列中导入限制性核酸酶识别/切割位点。引物也可含有额外的序列和/或修饰或标记的核苷酸以便于获取或检测扩增子。dna的热变性、引物与其互补序列的退火和退火引物以dna聚合酶的延伸的重复循环导致靶序列的指数扩增。术语靶或靶序列指待扩增的核酸序列。术语模板指待扩增的原始核酸。
19.有益效果
20.本发明发现将cry1b.868基因插入植物(玉米)基因组dna后，cry1b.868转基因植物(玉米)显示出了东方黏虫抗性，并且在转基因植物(玉米)单拷贝插入cry1b.868基因，cry1b.868蛋白表达量在3μg/g样品时，具有优良的抗东方黏虫特性，东方黏虫的杀伤率在68％～76％左右。
附图说明
21.图1为本发明中含有cry1b.868核苷酸序列的重组克隆载体lp19-t构建流程图；
22.图2为本发明中含有cry1b.868核苷酸序列的重组表达载体lp-pt19构建流程图；
23.图3为本发明中转基因玉米植株接种东方黏虫的叶片损伤图，其中wt为野生型植株，ngm为经pcr检测为非转基因的玉米植株，cry1b.868为转基因玉米植株。
具体实施方式
24.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
25.实施例1 cry1b.868基因的获得和合成
26.由南京金斯瑞生物科技公司合成cry1b.868基因(seq id no：1)，合成的所述cry1b.868基因的5’端连接有ncoi酶切位点，3’端连接有ecori酶切位点。所述cry1b.868基因编码seq id no:2所示的cry1b.868杀虫蛋白。
27.实施例2载体构建
28.1、构建克隆载体
29.将实施例1合成的cry1b.868基因核苷酸序列连入克隆载体peasy-t5(transgen，beijing，china，cat：ct501-01)上，操作步骤按transgen公司产品peasy-t5载体说明书进行，得到重组克隆载体lp19-t，其构建流程如图1所示(其中kan+表示卡那霉素抗性基因；amp+表示氨苄青霉素抗性基因；puc origin表示质粒puc的复制区序列，可引导双链dna复制过程；lacz为lacz起始密码子；cry1b.868为实施例1合成cry1b.868基因的核苷酸序列)。
30.将重组克隆载体lp19-t用热激法转化大肠杆菌t1感受态细胞(transgen，beijing，china；cat.no：cd501)。其转化过程为：50μl大肠杆菌t1感受态细胞和10μl质粒dna(重组克隆载体lp19-t)混合后42℃水浴30s，37℃水浴45min，转化后在200rpm摇床上摇动1h，随后涂布在含有的氨苄青霉素(100mg/l)的lb平板(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂15g/l，用naoh调ph至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，氨苄青霉素100mg/l，用naoh调ph至7.5)中于37℃条件的摇床上培养过夜。利用碱法提取质粒，具体步骤为：将菌液12000rpm离心1min，弃上清液，沉淀菌体用100μl提前用冰预冷的溶液i(25mmtris-hcl，10mm edta(乙二胺四乙酸)，50mm葡萄糖，ph调至8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液ii(0.2m naoh，1％sds(十二烷基硫酸钠))，将离心管上下颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液iii(4m醋酸钾，2m醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用质量浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含rnase(20μg/ml)的te(10mmtris-hcl，1mm edta，ph调至8.0)溶解沉淀；37℃下水浴30min，消化rna；最后保存在-20℃冰箱中备用。
31.提取的质粒经ncoi和ecori酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体lp19-t中插入的所述cry1b.868核苷酸序列为序列表中seq id no:1所示的核苷酸序列，即cry1b.868核苷酸序列正确插入。
32.2、构建含有cry1b.868基因的重组表达载体
33.用限制性内切酶ncoi和ecori分别酶切重组克隆载体lp19-t和表达载体lp-bb1(载体骨架：pcambia3301(cambia机构提供))，将切下的cry1b.868核苷酸序列片段插入到表达载体lp-bb1的ncoi和ecori位点之间，构建成重组表达载体lp-pt19，其构建流程如图2所示(kanr：卡那霉素抗性基因；rb：右边界；cry1b.868：cry1b.868核苷酸序列(seq id no:
1)；nos：胭脂碱合成酶的终止子(seq id no:3)；pat：编码磷丝菌素乙酰转移酶基因(seq id no:4)；pzmubi1：玉米ubiquitin(泛素)基因启动子(seq id no:5)；35s：指来自花椰菜花叶病毒(camv)的终止子(seq id no:6)；lb：左边界)。
34.将重组表达载体lp-pt19用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞。其转化过程为：50μl大肠杆菌t1感受态细胞和10μl质粒dna(重组表达载体lp-pt19)混合后42℃水浴30s，37℃水浴45min，转化后在200rpm摇床上摇动1h，随后涂布在含有的氨苄青霉素(100mg/l)的lb平板(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂15g/l，用naoh调ph至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，卡那霉素50mg/l，用naoh调ph至7.5)中于37℃摇床上培养过夜。碱法提取其质粒，提取方法同上。将提取的质粒用限制性内切酶ncoi和ecori进行酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序，结果表明重组表达载体lp-pt19在ncoi和ecori位点间的核苷酸序列为序列表中seq id no:1所示核苷酸序列，即cry1b.868核苷酸序列。
35.实施例3重组表达载体转化农杆菌及检测
36.(一)重组表达载体转化农杆菌
37.对己构建正确的重组表达载体lp-pt19用液氮法转化到农杆菌lba4404(invitrgen，chicago，usa；cat.no：18313-015)中，其转化条件为：100μl农杆菌lba4404和3μl质粒dna(重组表达载体)置于液氮中冷冻10min，37℃水浴10min；将转化后的农杆菌lba4404接种于装有lb液体培养基的离心管中于置于28℃、200rpm条件的摇床上培养2h，涂布于含50mg/l利福平(rifampicin)和50mg/l卡那霉素(kanamycin)的lb固体培养基上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶noti和sali对重组表达载体lp-pt19酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体lp-pt19结构完全正确。
38.(二)农杆菌介导玉米幼胚的遗传转化
39.1.玉米幼胚的准备
40.将公司内部玉米自交系ax808种植于大田或温室中，取人工授粉后8-10天(夏季)/10-13天(秋季)的玉米作为幼胚来源。
41.2.农杆菌的准备
42.(1)取已转化鉴定好的甘油农杆菌在含有100mg/l kan(卡那霉素)和12mg/l tet(四环素)的yep固体培养基上划线后于28℃暗培养2-3天；
43.(2)在灭菌的2ml离心管中加入1ml侵染培养基，取步骤(1)的农杆菌放入侵染培养基中，并用移液枪充分吹打混匀；
44.(3)另取一灭菌的2ml离心管，用侵染培养基调菌液浓度，使od 660达到0.5-0.7。
45.3.玉米幼胚与农杆菌的共培养
46.(1)除去装幼胚离心管中的侵染培养基，加入1.5ml新鲜侵染培养基将胚清洗一次；
47.(2)除去侵染培养基，加入调好的农杆菌菌液；
48.(3)置于摇床最大转速震荡30s，室温放置5min；
49.(4)将胚倒到共培养基上，吸干液体；
50.(5)将胚平面朝上，盾面朝下放置；(6)将胚放到22℃暗培养2-3天。
51.4.愈伤的诱导和筛选
52.(1)共培养后的胚转到诱导愈伤培养基上，28℃培养箱中暗培养7-10天；
53.(2)将诱导好的愈伤转到筛选培养基上进行筛选培养，筛选压为5.0mm草甘膦，28℃暗培养2-3周；
54.(3)取第一次筛选存活的愈伤进行第二次筛选，筛选压为2.0mm草甘膦。
55.5.转化株系的再生与培养
56.(1)取筛选后长出的胚性愈伤放到预分化培养基上，28℃暗培养10-14天；
57.(2)取胚性愈伤到分化培养基上，28℃光培养10-14天，直到幼苗分化出来；
58.(3)将分化好的幼苗转到生根培养基上，28℃光培养，直到根发育完全；
59.(4)将长势良好的幼苗移栽至温室基质内生长。
60.待转基因植株开花结实后收种。将收获的种子播种在温室，植株长到4-6叶期时，采用pcr技术进行表达分析检测。
61.(三)转基因玉米的检测
62.1、用全式金公司2
×
easytaqpcrsupermix(china，beijing，cat:as111-11)普通pcr验证转入cry1b.868基因的玉米植株。
63.pcr检测所用引物为：
64.引物1(cf1):atccagcgttactacgagcg(seqidno:7)；
65.引物2(cr1):ggatgttaatgcccgcgaac(seqidno:8)。
66.片段大小：580bp。
67.pcr反应的条件：95℃30s,58℃30s,72℃40s，循环30次。
68.2、用qrt-pcr验证转入cry1b.868基因的玉米植株
69.检测cry1b.868基因拷贝数的具体方法如下：(1)分别取转入cry1b.868核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；(2)使用easypureplantgenomicdnakit(含rnasea)(transgen，beijing，china，cat:ee111-01)提取上述样品的基因组dna，具体方法参考其产品说明书；(3)用nanodrop2000(thermoscientific,usa)测定上述样品的基因组dna浓度；(4)调整上述样品的基因组dna浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；(5)采用transstartgreen荧光定量pcr方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品。同时以野生型玉米植株的样品为对照，每个样品3个重复，取平均值。
70.以下引物用来检测cry1b.868核苷酸序列：
71.引物3(cf2)：gctacagggcctgggaaac(seqidno:9)；
72.引物4(cr2)：gtcatccctgttctccaacca(seqidno:10)；
73.探针1(cp1)：6-fam-cctttcgggcataccagcagtcactg-bhq-2(seqidno:11)。
74.以下引物用来检测18s的核苷酸序列，用于内参调平。
75.引物5(cf3)：ggatcagcgggtgttactaatagg(seqidno:12)；
76.引物6(cr3)：ccccggaacccaaagact(seqidno:13)；
77.探针2(cp2):vic-ccccgctggcaccttatgagaaatc-bhq-2(seqidno:14)。
78.pcr反应体系为：
79.greenqpcrsupermix(transgen)10μl
80.10μmforward引物1μl
81.10μm reverse引物1μl
82.passive reference dye i(50x)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.4μl
83.基因组dna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2μl
84.水(ddh2o)5.6μl
85.pcr反应条件为：
86.步骤温度时间
[0087][0088]
重复步骤2-3,40次。
[0089]
利用sds2.3软件(applied biosystems)分析数据。
[0090]
实验结果表明，cry1b.868核苷酸序列己整合到所检测的玉米植株染色体组中，而且转入cry1b.868核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝cry1b.868基因的转基因玉米植株。
[0091]
实施例4转基因玉米植株的杀虫蛋白质检测
[0092]
1、转基因玉米植株的杀虫蛋白质含量检测
[0093]
本实施例涉及的溶液如下：
[0094]
萃取缓冲液：8g/l nacl，0.2g/l kh2po4，2.9g/l na2hpo4·
12h2o，0.2g/l kcl，5.5ml/l吐温20(tween-20)，ph 7.4；
[0095]
洗涤缓冲液pbst：8g/l nacl，0.2g/l kh2po4，2.9g/l na2hpo4·
12h2o，0.2g/l kcl，0.5ml/l吐温20(tween-20)，ph 7.4；
[0096]
终止液：1m hcl。
[0097]
取3mg转入cry1b.868核苷酸序列的玉米植株的新鲜叶片作为样品，液氮研磨后加入800μl所述萃取缓冲液，4000rpm离心10min，取上清液用所述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于elisa检测。用elisa(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(envirlogix公司)对样品中杀虫蛋白质(cry1b.868蛋白)量占叶片鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考产品说明书。
[0098]
同时以野生型玉米植株和经荧光定量pcr鉴定为非转基因的玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。转入cry1b.868核苷酸序列的共3个株系(s1、s2和s3)，经荧光定量pcr鉴定为非转基因的(ngm)共1个株系，野生型的(ck)共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。
[0099]
转基因玉米植株的杀虫蛋白质(cry1b.868蛋白)含量测定结果如表1所示。测得转入cry1b.868核苷酸序列的玉米植株的新鲜叶片中杀虫蛋白(cry1b.868蛋白)的平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)为3241.7，这一结果表明cry1b.868蛋白在玉米中均获得了较高的表达量和稳定性。
[0100]
表1、转基因玉米植株的cry1b.868蛋白表达量测定结果
[0101][0102]
实施例5转基因玉米植株的抗虫效果检测
[0103]
将转入cry1b.868核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经pcr鉴定为非转基因的玉米植株对东方黏虫进行抗虫效果检测，具体步骤如下：
[0104]
分别取转入cry1b.868核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株(wt)和经pcr鉴定为非转基因的玉米植株(ngm)(v3-v4期)的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用滤纸将叶片上的水吸干，然后去除叶脉，剪成约3cm
×
1cm的长条状，取2片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的东方黏虫(初孵幼虫)，虫试培养皿加盖后，在温度22-26℃、相对湿度70％-80％、光周期16h光照/8h黑暗的条件下放置3天后，统计死亡率。结果如表2和图3所示，转入cry1b.868核苷酸序列的玉米转基因株系对东方黏虫具有良好抗性。
[0105]
表2玉米离体叶片抗虫生测结果
[0106] wtngmcry1b.868接虫数5050503d死亡率16％
±
5％a18％
±
4％a68％
±
8％b4d死亡率18％
±
4％a22％
±
4％a76％
±
5％b
[0107]
注：表中数据为平均值
±
标准误；同行数字后的不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0108]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。