一种多通道的细胞电转仪的制作方法

1.本发明涉及生物仪器设备领域，尤其涉及一种多通道的细胞电转仪。


背景技术：

2.电穿孔技术是一种通过外加电场在细胞膜两侧形成电势差，扰乱磷脂双分子层的排列，产生连通细胞内外的膜孔的技术。膜孔的数量，位置，尺寸，持续时间，以及恢复能力等与诸多因素有关。包括电场的强度，能量分布，细胞的理化环境，细胞的大小，状态，细胞膜的局部结构等。在膜孔持续的时间内，外源性物质，例如质粒，rna，蛋白，或者多糖等，有一定几率进入细胞中。因此，电穿孔技术在基因编辑，胚胎改造，细胞机理研究，蛋白生产，细胞治疗等领域有着广泛的用途。
3.与其它转染方式相比，电穿孔转染具有不可替代的优势。常用的化学转染方法，例如磷酸钙沉淀法，脂质体法(lipofectamine 2000等)，阳离子高聚物法(pei等)，依赖于细胞的吞噬能力，并且载体要经过溶酶体逃逸到细胞中，才有可能实现转染。因此，对于吞噬能力弱的细胞，例如原代细胞，悬浮细胞等，和溶酶体能力强的细胞，例如巨噬细胞等，化学方法的转染效率很低。对于类似这样的难转细胞，常常不得不用到病毒感染的方法。但是病毒选择和制备的周期长，操作繁琐，成本高。对插入片段的大小也有限制，不能超过2500bps。而很多常用的编辑工具，例如crispr-cas9等，需要转入大片段的质粒，一定程度上限制了病毒感染的应用。此外，由于病毒感染的原理是改变基因组，具有很大的风险，因此很难应用在临床开发上。电穿孔转染可以有效地转染难转细胞，对质粒大小没有限制，而且是瞬时转染，嵌入基因组的几率很低，常常作为化学和病毒方法的补充手段。
4.目前常见的电转仪有bio-rad的gene pulser xcell，thermo fisher的neon系统，和lonza的nucleofector等。bio-rad的电转仪采用比色皿式的电转板，可以输出简单的方波或者指数衰减波，使用电转缓冲液减少细胞的死亡率。neon系统在这个基础上将电转板改成电转吸头，减小了电极间的距离，使电场更加均匀，从而提高细胞的存活率。nucleofector在电转缓冲液中加入了促进质粒进入细胞核的试剂，即核转试剂，以提高转染效率。并针对不同细胞，提供不同配方的电转缓冲液，以提高细胞的存活率。虽然存在一定程度上的改进，但这些仪器没有从根本上解决电转随机性的问题，在转染效率和细胞成活率方面没有质的改善，而且实验结果之间差异很大，难以预料。一次典型的实验中，常常需要测试多个样品，而一般的电转仪一次只能操作一个样品，不利于样品间的平行比较，操作也更加繁琐。


技术实现要素：

5.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有的电转仪存在的电转随机性、转染效率低、细胞成活率低及实验结果不准确等问题，并且实现对多个细胞样品同时进行电穿孔转染。本发明提供了一种多通道的细胞电转仪，对生长在多个嵌入皿上的细胞进行电穿孔和外源性物质的导入。装置可以一次性地对1-6个嵌入皿内的样品分别
单独操作，样品之间不会互相干扰，增强了样品间的可比性，而且大大提高了实验效率，简化了操作。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种多通道的细胞电转仪，包括外壳、触控显示模块、电源模块和微控制器模块，还包括多通道电转模块和驱动模块，多通道电转模块与驱动模块设置在外壳内部，其中，驱动模块设置为xyz轴驱动，用于驱动多通道电转模块移动。
7.进一步地，多通道电转模块包括上电极触头、电转板、下电极触头和抽拉模块，上电极触头、所述电转板、下电极触头和抽拉模块自上而下依次布置，驱动模块与上电极触头连接并驱动上电极触头运动；电转板设置为安装在下电极触头上，下电极触头设置在抽拉模块上，抽拉模块用于使电转板、下电极触头与多通道细胞电转仪抽拉连接。
8.进一步地，电转板包括多孔板、上电极、下电极、密封圈和细胞嵌入皿，多孔板包括多个孔位，一个孔位为一个通道，孔位用于放置细胞嵌入皿，当细胞嵌入皿放入孔位后，细胞嵌入皿的皿底与下电极接触，细胞嵌入皿的皿底设置为由纳孔膜制作，具有纳米微通道，细胞嵌入皿内细胞培养在纳孔膜上；孔位以的下电极作为孔底，以密封圈密封多孔板孔底，上电极作为孔位的孔顶。
9.进一步地，抽拉模块设置为抽屉，下电极触头与抽屉固定连接。
10.进一步地，下电极触头包括槽位板、电极柱和压簧，电极柱通过压簧安装在槽位板上，电极柱设置为多个，并且电极柱之间设置为并联关系。
11.进一步地，电转板放置在槽位板上时，下电极与电极柱接触，并且每个下电极与一个或多个电极柱接触。
12.进一步地，上电极触头包括电极柱，电极柱设置为在驱动模块的驱动下与电转板的上电极接触。
13.进一步地，还包括传感器模块，传感器模块设置为用于检测多通道电转模块是否到位。
14.进一步地，细胞嵌入皿的纳孔膜材质设置为塑料、高分子材料、超过分子材料、金属中的一种，纳孔膜厚度设置为0-10mm，的纳孔膜微通道孔径0-1000μm。
15.进一步地，纳孔膜微通道孔设置为通过粒子加速撞击，蚀刻、编织、激光打孔等工艺制作。
16.技术效果
17.1、本发明的一种多通道的微通道细胞电转仪操作简单，在细胞嵌入皿中完成细胞培养，将细胞嵌入皿放置多孔板的孔位中，放入正电极，关闭抽屉，通过触控显示屏，正极柱会下移压住正电极，在压簧的张力作用下，正极柱和正电极接触稳固，负电极和负极柱接触稳固，从而和微控制器单元形成相电联接，输入脉冲电压的能量等级和输入时间等，可在极短的时间内完成精确的电转染过程；
18.2、细胞在细胞嵌入皿中完成细胞培养，细胞位于纳孔膜上，在电场的作用下，外源性物质可定向导入到细胞内部，提高了外源性物质的导入效率，试验表明导入率从25％提高到了90％左右；
19.3、微控制单元发出的低电压，结合阶段脉冲，极限的控制和适时释放相对应强度的电场，提高了细胞的存活率，从25％提高到了90％以上。
20.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以
充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
21.图1是本发明的一个较佳实施例的一种多通道的细胞电转仪的多通道电转模块和驱动模块示意图；
22.图2是本发明的一个较佳实施例的一种多通道的细胞电转仪的电转板结构示意图；
23.图3是本发明的一个较佳实施例的一种多通道的细胞电转仪的电转板的局部放大示意图；
24.图4是本发明的一个较佳实施例的一种多通道的细胞电转仪的下电极触头结构示意图；
25.图5是本发明的一个较佳实施例的一种多通道的细胞电转仪的下电极触头的局部放大示意图；
26.图6是本发明的一个较佳实施例的一种多通道的细胞电转仪的外壳造型示意图。
具体实施方式
27.为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定内部程序、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。在其它情况中，省略对众所周知的系统、装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本发明的描述。
29.本发明公开了一种多通道的细胞电转仪，如图6所示，包括外壳26、触控显示模块24、电源模块和微控制器模块，还包括多通道电转模块和驱动模块，多通道电转模块与驱动模块设置在外壳内部，其中，驱动模块设置为xyz轴驱动，用于驱动多通道电转模块移动。
30.如图1所示，多通道电转模块包括上电极触头4、电转板7、下电极触头6和抽拉模块8，上电极触头4、电转板7、下电极触头6和抽拉模块8自上而下依次布置，驱动模块与上电极触头连接并驱动上电极触头运动；电转板设置为安装在下电极触头上，下电极触头设置在抽拉模块上，抽拉模块用于使电转板、下电极触头与多通道的微通道细胞电转仪抽拉连接，本实施例中，抽拉模块设置为抽屉，下电极触头与抽屉固定连接。
31.如图2和图3所示，电转板7包括多孔板15，上电极13、下电极12、密封圈14和细胞嵌入皿11，多孔板包括多个孔位，一个孔位即为一个通道，孔位用于放置细胞嵌入皿11，细胞嵌入皿11的皿底设置为由纳孔膜制作，具有纳米微通道，细胞嵌入皿内液体细胞培养在纳孔膜上；孔位以的下电极12作为孔底，以密封圈14密封多孔板孔底，并用于注入待转的液体外源性物质(质粒，rna，蛋白，或者多糖等)。上电极13作为孔位的孔顶。电转板的孔位可以是1-96个，本实施例中选用6个孔位，即6通道。电转板的每个孔位底部都安装有一个下电极，下电极以下方式安装到多孔板底部：下电极外周套有软胶密封圈，下电极和软胶密封圈放置多孔板模腔内，和多孔板一体注塑成型，多孔板上方每个孔位均可放置一个所述的细
胞嵌入皿和上电极，下电极和上电极材质不限，可以是石墨、金属和导电塑料等导体，本实施例中下电极和上电极材质选用低电阻的石墨加工制成，其电阻率必须小于10-5
ω
·
m，下电极表面开有液体槽，液体槽深度0-1000mm，直径0-1000mm，液体槽槽口形状可以是圆柱腔、矩形腔、多边形腔、椭圆腔，上电极与液体样品接触的端面可以是平面的、圆弧面、椎体面、多边形面，上电极和纳孔膜间距0-1000mm。
32.本实施例中，细胞嵌入皿由绝缘材质制成，皿口的法兰可以是圆形、方形、椭圆形、多边形，细胞嵌入皿底部焊接有纳孔膜，焊接可以是热熔焊接、热压焊接、胶粘焊接、激光焊接、超声焊接、高周波焊接，纳孔膜材质可以是塑料、高分子材料、超过分子材料、金属，纳孔膜厚度0-10mm，纳孔膜微通道孔径0-1000μm，纳孔膜微通道孔是可以通过栗子加速撞击，蚀刻、编织、激光打孔等工艺制作。
33.如图4和图5所示，下电极触头包括槽位板16、电极柱17和压簧18，电极柱17通过压簧18安装在槽位板16上，每一个电极柱均设有压簧，电极柱17设置为多个，并且电极柱之间设置为并联关系，并且可以单独和下电极相电连接。按压电极柱，电极柱会在压簧的弹力作用下复位。电转板放置在槽位板上时，下电极与电极柱接触，并且每个下电极与一个或多个电极柱接触。本实施例中，槽位板上安装有24个电极柱，电极柱电阻率必须小于10-5
ω
·
m。电极柱和下电极接触的面为滚花状，上述滚花标准根据gb/t6403.3-2008相关参数，上述滚花可以是直纹滚花也可以是网纹滚花，滚花模数小于等于0.5。电极柱和下电极接触的面还可以是其他有规律的齿状触点，其作用是更有效的使所述的电极柱和下电极充分牢固的接触，保证电压、电流稳定可靠；电极柱可以1-6个同时和下电极相电连接。本实施例中，电转板为绝缘材料加工制成，电转板和槽位板相互匹配，便于定位电转板。
34.如图1所示，上电极触头4包括电极柱5，电极柱5设置为在驱动模块的驱动下与电转板的上电极接触。电极柱电阻率必须小于10-5
ω
·
m，电极柱和上电极接触的面为滚花状，上述滚花标准根据gb/t6403.3-2008相关参数，上述滚花可以是直纹滚花也可以是网纹滚花，滚花模数小于等于0.5。电极柱和上电极接触的面还可以是其他有规律的齿状触点，其作用是更有效的使所述的电极柱和上电极充分牢固的接触，保证电压、电流稳定可靠。
35.驱动模块包括y轴驱动组件1、x轴驱动组件2、z轴驱动组件3，电极柱可以在z轴驱动组件驱动下上下移动，z轴驱动组可以在x轴驱动组件的驱动下左右移动，x轴驱动组件可以在y轴驱动组件的驱动下前后移动，电极柱可以在x轴驱驱动组件、y轴驱动组件、z轴驱动组件的带动下在电转板上方任一方向移动。电极柱可以下移压住电转板上的任一个上电极，当电极柱、电极柱和微控制器单元相电连接时，微控制器单元和电源模块相电联接，仪器输出电脉冲，完成样品的电穿孔导入。
36.进一步地，本发明实施例的一种多通道的细胞电转仪还包括传感器模块9，传感器模块设置为用于检测多通道电转模块是否到位，传感器模块9设置在靠近抽屉口处。
37.本发明实施例提供的一种多通道的细胞电转仪的使用方法及原理如下：
38.在使用时，预先在细胞嵌入皿内培养一定时间的液体细胞，细胞并附着在纳孔膜上，预先注入适量的液体外源性物质至电转板的孔位内，从而保证上电极和下电极形成可通电的导通连接，将导通连接好的电转板放置到槽位板上，此时下电极和电极柱接触，并且每个下电极均和4个电极柱接触，再关闭抽屉，传感器检测到抽屉已关闭，通过触控显示模块下达指令，电极柱会下移压住上电极，在压力簧的张力作用下，电极柱和上电极接触稳
固，下电极和电极柱接触稳固，从而和微控制器单元形成相电联接，微控制器单元接收到指令并输出脉冲电压，使纳孔膜两侧形成可控的稳定的电场，进而使外源性物质注入细胞内。
39.在上述细胞电转仪中，机壳上设置有一触控显示屏，用户可在触控屏上段度设置各个样品的电穿孔参数，触控显示屏与微控制单元相联接，上电极柱、下电极柱和微控制单元相联接，微控制单元上置入了电压发生单元、电流检测单元、脉冲开关单元、可编程单片机其他微处理器等，通过电压发生单元、脉冲开关单元发出极低电压的脉冲，完成电穿孔导入。
40.本发明的一种多通道的细胞电转仪的使用过程如下：
41.1、抽屉弹出，将1-6个细胞嵌入皿放置多孔板的孔位中，放入上电极，抽屉收回，下电极与仪器内部的下电极触头接触。通过触控显示屏设置参数。点击开始后，上电极触头下移，与第一个样品的上电极接触，形成通路。仪器输出电脉冲，完成第一个样品的电穿孔导入；
42.2、第一个样品完成后，微控制单元结合传动装置移动并重新定位上电极触头至下一个样品，并按照设置的参数完成第二个样品的操作，以此类推；
43.3、大概几秒内，所有样品完成后，抽屉弹出，细胞样品可以取出放回原处继续培养。
44.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。