丙肝病毒检测相关肽及其可视时间分辨荧光微球试纸条的制作方法

1.本发明属于免疫学领域，具体涉及一种基于可视时间分辨荧光微球快速检测丙型肝炎病毒抗原抗体免疫层析试纸条及其中的相关肽。


背景技术：

2.丙型肝炎(丙肝，hcv)是世界性传染病之一，据世界卫生组织统计，全球hcv感染率已达3％，而高度慢性化是该病的最大特征，所产生的抗-hcv可存在于患者体内长达数年至十几年，甚至是终身存在，与乙肝相比，其危害性明显大于乙肝，丙肝80％患者会发展成慢性肝炎，且有相当的比例发展成肝硬化、肝癌，给患者及其家庭、社会带来长期痛苦和巨大的经济负担。
3.目前免疫检测hcv的方法主要是hcv抗体检测，检测hcv-ab。然而，本发明人长期研究发现，该检测方法对灰区结果判读的可靠性较差，且抗体窗口期较长，一般情况下感染 hcv后需70天甚至数月才产生hcv抗体，故不能作为早期诊断丙肝的感染。另外，hcv-ab 也无法区别患者为现症感染或者既往感染，而且长期使用免疫抑制制剂及血液透析患者可出现hcv-ab持续阴性。
4.hcv核心抗原是hcv颗粒的结构蛋白，在各亚型hcv中高度保守，尤其是本发明人认识到，hcv核心抗原几乎与hcv-rna同时出现，二者检测窗口期仅差1～2天，极大的缩短了检测的窗口期，能检测早期急性感染，弥补了hcv抗体检测的不足。因而，在现有技术没有启示的情况下，本发明人试图开发能同时检测hcv抗体和hcv核心抗原的简便易用的检测产品(如，免疫层析试纸条产品)。
5.在开发中，以及以前大量免疫层析试纸条产品的开发中，本发明人注意到了为人忽视的关键中间产物，即质控肽，及其由其产生的抗体不能干扰检测反应的进行，然而，hcv的c、 e1、e2、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b等蛋白产生的抗体以及人体由于感染其他病原体产生的抗体十分复杂，很容易造成干扰，导致需要重新测量。为此，本发明人在没有启示的情况下，精心研制了质控肽，至今在实际样品的检测中没有发现由于质控肽引起的错误。
6.另外，本发明人还优化了hcv半抗原和抗原，使之适合准确、灵敏、方便、快捷地同时检测hcv抗体和hcv核心抗原。并结合时间分辨荧光分析法(时间分辨荧光免疫分析， time-resolved fluoroimmunoassay,trfia)，选用合适的可视化时间分辨荧光微球，使得本发明的免疫层析试纸条产品既有时间分辨技术的灵敏度高、背景低的特点，又有胶体金技术特有的可肉眼观察结果，方便、快捷，同时适合装备荧光检测设备的实验室，也适合急诊检验、小型化验室或家中自测，具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题在于提供新的检测hcv的快速、可靠、便捷、同时适用范围广的免疫层析试纸条等检测产品及其中所用的相关肽。
8.具体而言，在第一方面，本发明提供了用于hcv检测的质控肽，其氨基酸序列如seq idno：1所示。质控肽的研究通常为人所忽视，然而，本发明人长期实践发现由于质控肽的设计不合理导致了实际60％的重测率，因此本发明人自主设计了本发明的质控肽，能够有效避开hcv和其他病原体所产生的天然抗体，大幅降低了重测率。在另一方面，本发明提供了质控肽-bsa，其为本发明第一方面的质控肽与牛血清白蛋白的偶联物。偶联可以按照常规的半抗原与蛋白载体化学偶联的方法进行。在又一方面，本发明提供了靶向质控肽的抗体，其靶向本发明第一方面的质控肽。抗体优选是单克隆抗体(单抗)。抗体的制备可以通过常规的免疫动物的方法来制备，其中免疫原可以是以上质控肽-bsa。还在一个方面，本发明提供了可视时间分辨荧光微球标记的质控肽-bsa，其为本发明的质控肽-bsa与可视时间分辨荧光微球的偶联物。偶联可以按照可视时间分辨荧光微球厂商提供的化学偶联的方法进行。
9.在第二方面，本发明提供了hcv半抗原，其氨基酸序列如seq id no：2所示。本发明第二方面的半抗原及靶向它的抗体不但能用于有效检测hcv核心抗原，而且与靶向本发明第三方面的半抗原的抗体之间没有可检测的交叉反应性，且不影响靶向本发明第三方面的半抗原的抗体对hcv核心抗原的结合。在另一方面，本发明提供了半抗原-bsa，其为本发明第二方面的半抗原与牛血清白蛋白的偶联物。偶联可以按照常规的半抗原与蛋白载体化学偶联的方法进行。在又一方面，本发明提供了靶向半抗原的抗体，其靶向本发明第二方面的半抗原。抗体优选是单克隆抗体(单抗)。抗体的制备可以通过常规的免疫动物的方法来制备，其中免疫原可以是以上半抗原-bsa。还在一个方面，本发明提供了可视时间分辨荧光微球标记的靶向半抗原的抗体，其为靶向本发明第二方面的半抗原的抗体与可视时间分辨荧光微球的偶联物。偶联可以按照可视时间分辨荧光微球厂商提供的化学偶联的方法进行。
10.在第三方面，本发明提供了hcv半抗原，其氨基酸序列如seq id no：3所示。本发明第三方面的半抗原及靶向它的抗体不但能用于有效检测hcv核心抗原，而且与靶向本发明第二方面的半抗原的抗体之间没有可检测的交叉反应性，且不影响靶向本发明第二方面的半抗原的抗体对hcv核心抗原的结合。在另一方面，本发明提供了半抗原-bsa，其为本发明第三方面的半抗原与牛血清白蛋白的偶联物。偶联可以按照常规的半抗原与蛋白载体化学偶联的方法进行。在又一方面，本发明提供了靶向半抗原的抗体，其靶向本发明第三方面的半抗原。抗体优选是单克隆抗体(单抗)。抗体的制备可以通过常规的免疫动物的方法来制备，其中免疫原可以是以上半抗原-bsa。还在一个方面，本发明提供了可视时间分辨荧光微球标记的靶向半抗原的抗体，其为靶向本发明第三方面的半抗原的抗体与可视时间分辨荧光微球的偶联物。偶联可以按照可视时间分辨荧光微球厂商提供的化学偶联的方法进行。
11.在第四方面，本发明提供了hcv抗原，其氨基酸序列如seq id no：4所示。该抗原与天然人体产生的针对诸多表位的抗体能高效结合，因而能高效用于hcv抗体检测。在另一方面，本发明提供了可视时间分辨荧光微球标记的抗原，其为本发明第四方面的抗原与可视时间分辨荧光微球的偶联物。偶联可以按照可视时间分辨荧光微球厂商提供的化学偶联的方法进行。
12.在第五方面，本发明提供了用于荧光和/或肉眼检测hcv核心抗原的试纸条，其依次连接有样品垫、玻璃纤维膜、含检测区和质控区的硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，玻璃纤维膜包含可视时间分辨荧光微球标记的靶向本发明第三或第二方面的半抗原的抗体和可
视时间分辨荧光微球标记的质控肽-bsa，检测区包含靶向本发明第二或第三方面的半抗原的抗体，质控区包含靶向质控肽的抗体，其中，质控肽是本发明第一方面的质控肽，当靶向本发明第三或第二方面的半抗原的抗体是靶向本发明第三方面的半抗原的抗体时，靶向本发明第二或第三方面的半抗原的抗体是靶向本发明第二方面的半抗原的抗体；当靶向本发明第三或第二方面的半抗原的抗体是靶向本发明第二方面的半抗原的抗体时，靶向本发明第二或第三方面的半抗原的抗体是靶向本发明第三方面的半抗原的抗体。优选地，其中，靶向本发明第三或第二方面的半抗原的抗体是靶向本发明第三方面的半抗原的抗体，而且靶向本发明第二或第三方面的半抗原的抗体是靶向本发明第二方面的半抗原的抗体。
13.在第六方面，本发明提供了用于荧光和/或肉眼检测hcv抗体的试纸条，其依次连接有样品垫、玻璃纤维膜、含检测区和质控区的硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，玻璃纤维膜包含可视时间分辨荧光微球标记的hcv抗原和可视时间分辨荧光微球标记的质控肽-bsa，检测区包含hcv抗原，质控区包含靶向质控肽的抗体，其中，hcv抗原是本发明第四方面的抗原，质控肽是本发明第一方面的质控肽。
14.优选在制备本发明第五或第六方面的试纸条中，靶向本发明第二或第三方面的半抗原的抗体、hcv抗原和靶向质控肽的抗体分别用含有海藻糖的磷酸盐缓冲液配制后，再分别划膜于检测区和质控区。本发明人发现，添加一定量的海藻糖能够使得抗原和抗体保持原效价和特异性。海藻糖浓度为2～5％(w/w)，优选为3％(w/w)。
15.在第七方面，本发明提供了用于荧光和/或肉眼检测丙型肝炎病毒的免疫层析试纸条，其包括并排设置的本发明第五方面的试纸条和本发明第六方面的试纸条。本发明第七方面的试纸条可同时检测hcv核心抗原和hcv抗体。优选地，本发明第七方面的试纸条还可以包括底板和上盖。
16.在第八方面，本发明提供了本发明第五方面的试纸条或本发明第七方面的试纸条在制备用于荧光和/或肉眼检测hcv核心抗原的产品中的应用。
17.在第九方面，本发明提供了本发明第六方面的试纸条或本发明第七方面的试纸条在制备用于荧光和/或肉眼检测hcv抗体的产品中的应用。
18.本发明的有益效果在于，可实现一次反应的时间段内同时可定性且可定量地检测丙型肝炎病毒抗原、抗体指标检测时间短；检测灵敏度高，采用荧光测定，比胶体金方法灵敏度高 100倍以上，而且特异性强，反应速度快，准确性高，定量准确；肉眼即可判读结果，必要时无须额外仪器，使用简便，在一般的小型诊所或者家庭均可轻松使用，具有广阔的应用前景。
19.为了便于理解，下面将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别说明的是，具体实施例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然，本领域及相关领域的普通技术人员均可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变或丰富应用领域，这些修正和改变或在其他领域的应用也纳入本发明的范围。
附图说明
20.图1显示了本发明的示例性的快速检测可视时间分辨免疫荧光丙型肝炎病毒抗原抗体免疫层析试纸条，其中1为丙型肝炎病毒核心抗原检测条1，2为丙型肝炎病毒抗体检测
条2。
21.图2显示了本发明的示例性的快速检测可视时间分辨免疫荧光丙型肝炎病毒抗原抗体免疫层析试纸条在肉眼下对样品检测的观察结果，可用于定性分析。
22.图3显示了本发明的示例性的快速检测可视时间分辨免疫荧光丙型肝炎病毒抗原抗体免疫层析试纸条在荧光仪下对样品检测的观察结果，可用于定量分析。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。其中，硝酸纤维素膜(nc膜，型号sartorμgs cn 140，孔径为8μm，爬行速度110s/4cm)购自sartorius，可视时间分辨荧光微球，购自长沙美牛生物科技有限公司，丙型肝炎病毒抗原，购自北京科跃中楷生物技术有限公司。化学试剂等购自sigma。
24.实施例1本发明的质控肽
25.①
质控肽-bsa(牛血清白蛋白)的制备
26.a)质控肽序列：
27.我们以自主平台开发出了不干扰检测的质控肽(半抗原)，采用合成法合成质控肽(合成单位：生工生物工程上海(股份)有限公司)，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
28.b)质控肽-bsa(即质控肽和bsa的偶联物)的制备
29.将bsa用0.05m mes ph6.0溶为10mg/ml，取1ml加入0.4mg的edc，1.1mg的nhs 活化30min，加入1mg质控肽，偶联2h，加入乙醇胺10μl，封闭30分钟，用0.01m pbs ph7.4 进行透析。
30.②
质控肽单抗的制备
31.将质控肽-bsa作为抗原免疫小鼠，免疫过的小鼠获取脾细胞；应用公知的细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与b淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞，经分选和鉴定，获得能分泌靶向质控肽的抗体的杂交瘤细胞株，在小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，培养后对小鼠腹水用常规方法进行纯化，获得质控肽单抗。
32.③
可视时间分辨荧光微球标记的质控肽-bsa的制备
33.取1mg可视时间分辨荧光微球(购自长沙美牛生物科技有限公司，型号：mf03，粒径 300nm)用活化缓冲液(0.05m mes，ph6.0)1ml稀释至0.1mg/ml(w/t)，混匀,离心12000rpm， 30分钟，去上清(洗涤1次)，再加入活化缓冲液(0.05m mes，ph6.0)1ml稀释至0.1mg/ml (w/t)，混匀，得到可视时间分辨荧光微球溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)用无水乙醇溶解成10mg/ml,，分别按照与可视荧光微球质量比的1：10的比例，在可视荧光微球中分别加入10μl edc与nhs混合，25℃
±
0.1℃振荡45min，离心(12000rpm，30分钟)，弃上清，加入偶联液(0.01m pβs，ph7.2～7.4) 1ml，混匀，离心(12000rpm，30分钟)，弃上清，加入偶联液1ml混匀，得到洗涤后的荧光微球；然后按照每毫克可视荧光微球加入10μg质控肽本身的配比，在洗涤后活化微球中加入质控肽-bsa，25℃
±
0.1℃振荡90min；加入封闭液100μl(含40mm甘氨酸、1wt％βsa的 0.01m pβs，ph7.2～7.4)，25℃
±
0.1℃振荡90min，离心(12000rpm，30分钟)，弃上清，加入保存液(含0.5wt％casine，1wt％proclin300的0.01m pβs，ph7.2～7.4)1ml混匀，离心 (12000rpm，30分钟)，弃上清，将洗涤后的荧光微球用保存液稀释至1mg/ml，得到可视时间分辨荧光微
球标记质控肽-bsa。
34.实施例2丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体制备
35.根据hcv cag序列，我们以自主平台开发出了两个半抗原片段，委托合成(合成单位：生工生物工程上海(股份)有限公司)这两个片段，其中片段1的氨基酸序列如seq id no：2 所示，片段2的氨基酸序列如seq id no：3所示。
36.基本参照实施例1步骤
①
b)的方法，所不同的是用丙型肝炎病毒核心抗原片段1和2分别代替质控肽，分别获得丙型肝炎病毒核心抗原片段1-bsa和丙型肝炎病毒核心抗原片段 2-bsa；基本参照实施例1步骤
②
的方法，所不同的是用丙型肝炎病毒核心抗原片段1-bsa 和丙型肝炎病毒核心抗原片段2-bsa分别代替质控肽-bsa，分别获得丙型肝炎病毒核心抗原片段1和2的单克隆抗体1和2(即，丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体1和2)。
37.基本参照实施例1步骤
③
的方法，所不同的是用丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体2代替质控肽-bsa，配比为每毫克可视荧光微球加入抗体60μg，获得可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体2。
38.实施例3可视时间分辨荧光微球标记的丙型肝炎病毒抗原的制备
39.基本参照实施例1步骤
③
的方法，所不同的是用丙型肝炎病毒抗原代替质控肽-bsa，配比为每毫克可视荧光微球加入抗原20μg，获得可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒抗原，其中，丙型肝炎病毒抗原的氨基酸序列如seq id no：4。
40.实施例4检测条1(含检测区和质控区的硝酸纤维素膜)的制备
41.将丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体1和质控肽单抗用含有质量分数为3wt％海藻糖的 0.01m tris(ph＝8.0，使用前采用0.22μm进行过滤)分别稀释至浓度为2.5mg/ml和1mg/ml，将两者用划膜仪分别在nc膜上划膜，划膜速度为1μl/cm，其中，质控区(c)用质控肽单抗在1.4cm处划膜，丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体在0.9cm处划膜，形成检测区t，然后37℃干燥3.5h，得到设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜(即检测条1)，该硝酸纤维素膜保存条件为20℃。
42.实施例5检测条2(含检测区和质控区的硝酸纤维素膜)的制备
43.将丙型肝炎病毒抗原用含有质量分数为3％海藻糖的0.01m tris(ph＝8.0，使用前采用 0.22μm进行过滤)稀释至浓度为2.5mg/ml，其中，丙型肝炎病毒抗原的氨基酸序列如seq idno：4所示。
44.将上述丙型肝炎病毒抗原和实施例1制得的1mg/ml的质控肽单抗用划膜仪分别在nc膜上划膜，划膜速度为1μl/cm，其中，丙型肝炎病毒抗原在0.9cm处划膜，质控肽单抗在1.4cm 处划膜，形成检测区t和质控区c，然后37℃干燥3.5h，得到设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜(即检测条2)，该硝酸纤维素膜保存条件为20℃。
45.实施例6玻璃纤维膜的制备
46.将实施例2制得的可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体2、实施例3制得的可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒抗原及实施例1步骤
③
制得的可视时间分辨荧光微球标记质控肽-bsa分别涂覆在玻璃纤维膜上，每毫升涂覆8平方厘米的玻璃纤维垫，37℃干燥3.5h，分别得到包被可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体2、可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒抗原和可视时间分辨荧光微球标记质控肽
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bsa的玻璃纤维膜。
47.实施例7快速检测可视时间分辨免疫荧光丙型肝炎病毒免疫层析试纸条的制备
48.将检测条1(25mm*4mm)和检测条2(25mm*4mm)并排粘贴于底板中部(检测区朝底板前端，质控区朝末端)；包被可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体 2与可视时间分辨荧光微球标记质控肽-bsa的玻璃纤维膜上下重叠放置，裁成5mm*4mm，并紧贴于检测条1前端；包被可视时间分辨荧光微球标记丙型肝炎病毒抗原与可视时间分辨荧光微球标记质控肽-bsa的玻璃纤维膜上下重叠放置，裁成5mm*4mm；将样品垫(s) (28mm*4mm)各自紧贴于两叠玻璃纤维膜前端，将吸水垫(27mm*4mm)分别紧贴于检测条1和检测条2末端。任选加上上盖(在样品垫、检测区和质控区上开口)，得到快速检测可视时间分辨免疫荧光丙型肝炎病毒免疫层析试纸条(如图1所示)，将其装有干燥剂的密封袋中，存放于室温。
49.实施例8检测效果
50.(1)分别取待测样品100μl加入实施例7制得的检测条1和检测条2对应的样品垫，室温反应放置15分钟，样品经过免疫层析反应，首先目测初步判断结果，再用时间分辨荧光仪测定荧光值。
51.(2)丙型肝炎核心抗原检测条1剂量反应关系：平行测定丙肝核心抗原校准品，用含 5000pg/ml丙肝核心抗原(hcv-cag)进行稀释为校准品，测定校准品浓度(0、50、100、 500、1000、3000pg/ml)的荧光值，根据时间分辨荧光仪的软件，采用四参数数学模型进行拟合曲线作图。计算其线性相关系数，其丙型肝炎核心抗原相关系数为0.998。
52.(3)丙肝核心抗原分析灵敏度：平行测定20孔零值校准品的时间分辨荧光强度，计算时间分辨荧光强度的标准偏差(sd)和平均值(mean)，计算m＝mean+2
×
sd，通过四参数软件，将该值代入线性公式计算x值，再计算power即(mean+2sd)时对应的浓度值，为分析灵敏度。该试纸的丙肝核心抗原分析灵敏度为29.78pg/ml。
53.(3)丙肝抗体检测条2最低检出限：将中国食品药品检定研究所提供的丙型肝炎病毒抗体国家参考品(批号：300010-201509)中最低检出限参考品l3作为最低检出限，根据荧光强度值，l3/co(阈值)为2.3，(荧光值/co(阈值)≥1.0为阳性),确定l3为阳性，l4为阴性。
54.(4)精密性：平行测定10孔丙肝核心抗原样本(100pg/ml、500pg/ml)质控样本，中国食品药品检定研究所提供的丙型肝炎病毒抗体国家参考品(批号：300010-201509)精密性样本，分别计算测定荧光值结果的平均值(mean)与标准偏差(sd)，计算丙肝核心抗原、丙型肝炎病毒抗体精密度(cv％)＝sd/mean
×
100％。丙型肝炎核心抗原变异系数分别为7.25％、 6.33％；丙型肝炎病毒抗体变异系数为4.89％。
55.(5)样本测定：
56.用本发明的丙型肝炎病毒免疫层析试纸条分别测定中国食品药品检定研究所提供的丙型肝炎病毒抗体国家参考品(批号：300010-201509)、丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂国家参考品(批号：300023-201601)结果如下：
57.丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂国家参考品测定结果
[0058][0059][0060]
丙型肝炎病毒抗体检测试剂国家参考品测定结果
[0061]
[0062]
[0063][0064]
[0065]
通过对本发明的丙型肝炎病毒免疫层析试纸条分别测定中国食品药品检定研究所提供的丙型肝炎病毒抗体国家参考品、丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂国家参考品的测定，目测结果与时间分辨荧光仪测定结果一致，均符合国家标准。
[0066]
另外，通过不同途径，用本发明的丙型肝炎病毒免疫层析试纸条测试了临床确诊hcv感染的样品127份和临床确诊感染hbv或hev但未感染hcv的样品156份，阳性符合率和阴性符合率均为100％，且未发生由于质控结果而导致的重测现象。
[0067]
采用可视时间分辨荧光微球技术，测定丙型肝炎病毒抗原抗体免疫层析试纸条，既可目测，又可结果与荧光仪测定的定性结果一致，荧光仪通过测定校准品，采用四参数曲线，定量测定样本的浓度值，其既有时间分辨技术的灵敏度高、背景低的特点，又有胶体金技术特有的可肉眼观察结果，方便、快捷，具有广阔的应用前景。
[0068]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。