多肽及其应用、药物组合物的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种多肽及其应用、药物组合物。


背景技术：

2.坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，nec)为一种获得性疾病，是多种原因引起的肠黏膜损害，使之缺血、缺氧，导致小肠、结肠发生弥漫性或局部坏死的一种疾病。nec疾病主要发生在早产儿或患病的新生儿中，大多于生后2～12天发病，其发病机制尚不清楚，普遍认为是由于早产儿胃酸分泌少、胃肠动力差、蛋白酶活性低、消化道粘膜通透性高、消化吸收和局部免疫反应低下，因此在感染、肠壁缺血缺氧、不适当的肠道喂养等致病因素作用下易导致肠道损伤进而引发nec。nec患者起初时常有发热或体温不升、呼吸暂停、心动过缓、嗜睡等非特异性全身表现，随后可出现不同程度的呕吐、腹胀、腹泻及血便，查体可见肠形、腹壁发红，腹部压痛，右下腹包块，肠鸣音减弱或消失，严重者常并发败血症、肠穿孔和腹膜炎等。因此，nec是新生儿消化系统极为严重的疾病，也是引发肠穿孔和全身炎症反应综合征的重要原因。
3.nec疾病的病程长、预后差，存活的患儿还常伴有短肠综合征、肠狭窄和远期神经发育障碍等多种后遗症，不仅严重影响患儿生存质量，还给家庭和社会带来沉重的负担。由于确切病因和发病机制不清楚，目前临床上仍无有效的预防和治疗nec疾病措施，目前临床以抗生素和包括鼻胃管吸引、静脉补液、全肠外营养在内的支持治疗和晚期手术为主，但患儿术后病死率仍高达50％。因此，研究者们一直在积极寻求针对新生儿坏死性小肠结肠炎患儿更为有效、安全的预防和治疗措施，如何为防治新生儿坏死性小肠结肠炎提供有效手段是亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.基于此，本发明提供一种氨基酸序列如seq id no.1所示的多肽，该多肽具有抗新生儿坏死性小肠结肠炎的活性。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.本发明的第一方面，提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明的第二方面，提供上述多肽在制备抗新生儿坏死性小肠结肠炎的药物中的应用。
8.在其中一实施例中，所述药物包含第一方面所述的多肽以及药学上可接受的辅料。
9.在其中一实施例中，所述辅料选自稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂以及等渗或等张调节剂中的至少一种。
10.在其中一实施例中，所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种；或/和，所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种；或/和，所述黏合剂选自淀粉浆、
糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述崩解剂选自淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种；或/和，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；或/和，所述溶剂选自水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；或/和，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种；或/和，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种；或/和，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；或/和，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；或/和，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；或/和，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；或/和，所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种；或/和，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；或/和，所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；或/和，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
11.在其中一实施例中，所述药物的剂型为注射剂、口服液、粉剂、丸剂或者片剂。
12.在其中一实施例中，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或者经皮给药。
13.本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合包含第一方面所述的多肽及药学上可接受的辅料。
14.在其中一实施例中，所述辅料选自稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂以及等渗或等张调节剂中的至少一种。
15.在其中一实施例中，所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种。
16.在其中一实施例中，所述润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种。
17.在其中一实施例中，所述黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种。
18.在其中一实施例中，所述崩解剂选自淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种。
19.在其中一实施例中，所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种。
20.在其中一实施例中，所述色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种。
21.在其中一实施例中，所述溶剂选自水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、
液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种。
22.在其中一实施例中，所述增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种。
23.在其中一实施例中，所述助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种。
24.在其中一实施例中，所述乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种。
25.在其中一实施例中，所述抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种。
26.在其中一实施例中，所述金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种。
27.在其中一实施例中，所述惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种。
28.在其中一实施例中，所述防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种。
29.在其中一实施例中，所述局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种。
30.在其中一实施例中，所述ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种。
31.在其中一实施例中，所述等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
32.在其中一实施例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、口服液、粉剂、丸剂或者片剂。
33.在其中一实施例中，所述药物组合物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或者经皮给药。
34.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
35.本发明提供的如seq id no.1所示的多肽，具有防治新生儿坏死性小肠结肠炎的生物活性，并且该生物活性在nec细胞模型和nec动物模型上得以验证。该多肽的生物活性表现包括：在正常fhc细胞中，所述多肽不影响细胞的增殖和活力，而在nec细胞模型中，所述多肽能够显著抑制肠上皮细胞凋亡和降低炎症因子水平；在nec大鼠模型中，所述多肽能显著减轻肠损伤，恢复肠组织形态，使肠上皮细胞生长恢复，结构趋于完整，且炎症细胞浸润均明显减轻。本发明提供的多肽可用于制备抗新生儿坏死性小肠结肠炎的药物，给临床治疗新生儿坏死性小肠结肠炎提供更多的预防和治疗手段。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
leu)。
52.母乳喂养能够有效预防nec等多种早产相关疾病的发生，有研究表明，母乳喂养可使nec疾病的发生风险降低79％，但具体作用机制尚不明确。母乳是婴儿的重要营养来源，母乳蛋白可提供蛋白质合成所需的氨基酸，完整的母乳蛋白对婴儿有多种作用，如支持婴儿的免疫系统、阻止病原菌的生长、作为生长因子以及调控铁的吸收和运输等，母乳蛋白经消化水解后产生的生物活性肽也具重要的生物活性。生物活性肽作为母乳中的重要组成，具有抗感染、免疫调节、促进生长发育等多种作用，本发明以此为基础从母乳内源性生物活性肽的角度进一步寻找治疗nec疾病的多肽，借助质谱技术，对生理状态的母乳外泌体所含的内源性生物活性肽的组成进行了系统分析，从而发现了具有潜在生物学活性的多肽。
53.可以理解地，本发明提供的多肽可以采用本领域技术人员常用的固相合成方法制备，在此不过多赘述。
54.第二方面，本发明还提供上述多肽在制备抗新生儿坏死性小肠结肠炎的药物中的应用。
55.在其中一示例中，药物包含上述第一方面的多肽以及药学上可接受的辅料。
56.在其中一示例中，辅料选自稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂以及等渗或等张调节剂中的至少一种。
57.在其中一示例中，稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种；或/和，润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种；或/和，黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，崩解剂选自淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种；或/和，润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种；或/和，色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种；或/和，溶剂选自水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种；或/和，增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种；或/和，助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种；或/和，乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种；或/和，抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种；或/和，金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种；或/和，惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种；或/和，防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种；或/和，局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种；或/和，ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种；或/和，等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
58.在其中一示例中，辅料选自稀释剂、防腐剂、缓冲剂、崩解剂、抗氧剂、助悬剂、着色剂和赋形剂中的一种或多种。
59.在其中一示例中，药物的剂型为注射剂、口服液、粉剂、丸剂、片剂。进一步地，药物的剂型为注射剂。
60.在其中一示例中，药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或者经皮给药。进一步地，药物的给药途径为静脉注射。
61.第三方面，本发明还提供一种药物组合物，药物组合包含上述第一方面的多肽及药学上可接受的辅料。
62.在其中一示例中，辅料选自稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂以及等渗或等张调节剂中的至少一种。
63.在其中一示例中，稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类以及无机盐类中的至少一种。
64.在其中一示例中，润湿剂选自水以及乙醇中的至少一种。
65.在其中一示例中，黏合剂选自淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮以及聚乙二醇中的至少一种。
66.在其中一示例中，崩解剂选自淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂以及泡腾崩解剂中的至少一种。
67.在其中一示例中，润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶以及聚乙二醇中的至少一种。
68.在其中一示例中，色香味调节剂选自色素、香料、甜味剂、胶浆剂以及矫臭剂中的至少一种。
69.在其中一示例中，溶剂选自水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油以及乙酸乙酯中的至少一种。
70.在其中一示例中，增溶剂选自吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、以及磺酸化物中的至少一种。
71.在其中一示例中，助溶剂选自有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮以及甘油中的至少一种。
72.在其中一示例中，乳化剂选自司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅以及皂土中的至少一种。
73.在其中一示例中，抗氧剂选自亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类中的至少一种。
74.在其中一示例中，金属络合剂选自乙二胺四乙酸二钠以及多羧酸化合物中的一种。
75.在其中一示例中，惰性气体选自氮气以及二氧化碳中的一种。
76.在其中一示例中，防腐剂选自尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类以及挥发油中的至少一种。
77.在其中一示例中，局部止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因以及普鲁卡因中的至少一种。
78.在其中一示例中，ph调节剂选择盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化
钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐以及枸橼酸盐中的至少一种。
79.在其中一示例例中，等渗或等张调节剂选自葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
80.在其中一示例中，辅料选自稀释剂、防腐剂、缓冲剂、崩解剂、抗氧剂、助悬剂、着色剂和赋形剂中的一种或多种。
81.在其中一示例中，药物组合物的剂型为注射剂、口服液、粉剂、丸剂或者片剂。
82.在其中一示例中，药物组合物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或者经皮给药。
83.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
84.如无特殊说明，以下实验中所使用的试剂均来自于市售，操作方法均为现有的常规操作方法。其中，以下实验中使用的多肽购自上海科肽生物科技有限公司，命名为polypeptide 1(pp1)。
85.实施例1pp1对nec模型肠上皮细胞的影响
86.1.实验材料
87.fhc细胞：fetal human colon epithelial cell，人肠上皮细胞，购自atcc公司(crl-1831)。
88.2.实验分组
89.设置con组、nec组、nec+scr(打乱序列的scramble多肽)组和nec+pp1组。
90.3.实验方法
91.3.1细胞培养
92.fhc细胞于37℃、5％co2条件下培养，至生长密度为80％-90％，得到fhc细胞培养液。
93.3.2nec细胞模型构建
94.con组：对fhc细胞培养液不作脂多糖(lps)诱导处理处理；
95.nec组：向fhc细胞培养液中加入lps(100μg/ml)诱导3h，构建nec细胞模型；
96.nec+scr组：向fhc细胞培养液中加入对照肽scr(100μm)，1小时后加入lps(100μg/ml)诱导3h；
97.nec+pp1组：向fhc细胞培养液中加入多肽pp1(100μm)，1小时后加入lps(100μg/ml)诱导3h。
98.3.3细胞凋亡实验
99.(1)贴壁细胞染色：使用不含edta的胰酶消化后，在离心力为300g、温度为4℃条件下离心5min，收集细胞，其中胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性；
100.(2)用预冷的pbs洗涤细胞1次，在离心力为300g、温度为4℃条件下离心5min，收集细胞；
101.(3)重复步骤(2)一次，共收集(1～5)
×
105细胞；
102.(4)吸弃pbs，加入100μl 1
×
binding buffer重悬细胞；
103.(5)加入5μl annexin v-fitc和10μl pi staining solution，轻轻混匀，置于避光、室温条件下反应15min；
104.(6)加入400μl 1
×
binding buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细
胞仪或荧光显微镜检测；
105.(7)样品分析：fitc最大激发波长为488nm，最大发射波长525nm，fitc的绿色荧光在fl1通道检测；pi-dna复合物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm，pi的红色荧光在fl2或fl3通道检测。用cellquest等软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dot plot)，fitc为横坐标，pi为纵坐标。根据荧光的强度和颜色将细胞分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。
106.3.4细胞增殖实验
107.(1)将1
×
103个fhc细胞种入96孔板中，其中96孔板细胞培养板周围一圈不种细胞，置于37℃、5％co2培养箱中培养；
108.(2)24h后换液，分别于24h、48h及72h后向每孔中各加入10μl cck-8试剂，2h后利用酶标仪检测450nm处吸光度。
109.3.5rna提取
110.(1)样品准备：
111.细胞吸除培养基，用pbs清洗1-2次，随后每孔加入1000μl trizol试剂，使用去rnase酶枪头吹匀后，移置rnase free的1.5ml离心管中，存于-80℃冰箱待提取；
112.(2)细胞充分研磨后静置5min，将混合液转移至1.5ml无核酶ep管中并做好标记；
113.(3)加入200μl氯仿颠倒数次混匀，室温静置5min，在离心力为12000g、温度为4℃条件下离心15min；
114.(4)小心地转移上层水相400μl至新的无核酶ep管中，加400μl等量异丙醇颠倒混匀，室温静置10-20min，在离心力为12000g、温度为4℃条件下离心10min，弃上清；
115.(5)加入1ml冰冷的depc水配置的75％乙醇，在离心力为7500g、温度为4℃条件下离心5min，弃上清；
116.(6)室温10min晾干，用depc或无核酶水溶解吹打混匀，rna的浓度及纯度用nanodroptm2000测定。
117.3.6实时荧光定量pcr(rt-qpcr)
118.引物设计是通过primer5(http://sourceforge.net/projects/primer5/)在线引物设计网站进行设计，然后利用ncbi basic local alignment search tool(blast)工具进行比对来确保产物的特异性。
119.利用takara试剂盒逆转录为cdna，rt-pcr引物如表1所示：
120.表1
[0121][0122]
pcr体系如表2所示：
[0123]
表2
[0124][0125][0126]
pcr反应条件如表3所示：
[0127]
表3
[0128][0129]
利用sybr green法检测相应的基因表达水平，以gapdh作为内参。
[0130]
4.数据及统计学处理
[0131]
采用spss20.0统计分析软件分析，计量资料以均数
±
标准差表示，两样本均数之间的比较，经正态性检验和方差齐性分析后，选择t或t'检验，p《0.05表示差异具有统计学意义。
[0132]
5.实验结果
[0133]
5.1pp1不影响正常fhc细胞增殖，减少nec模型细胞凋亡且降低炎症因子水平
[0134]
为了探究多肽pp1本身是否影响fhc细胞的增殖，使用不同浓度的多肽pp1(0μm、20
μm、50μm和100μm)分别作用24h、48h和72h，结果显示多肽pp1在不同浓度下孵育不同时间均不影响fhc细胞增殖，即多肽pp1不影响肠上皮细胞活力(图1)。
[0135]
在nec细胞模型中，通过流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示多肽pp1可显著降低lps诱导的细胞凋亡，而对照肽scr对lps诱导的细胞凋亡无抑制效果(图2)。
[0136]
应用rt-qpcr进行检测，发现经lps诱导刺激后，tnf-α和il-6的水平显著升高，表明nec组中炎症水平上调，炎症介质释放增加，nec细胞模型构建成功。nec+scr组相较于nec组，tnf-α和il-6的水平并无降低效果，而nec+pp1组相较于nec组和nec+scr组，tnf-α和il-6的mrna水平显著降低(图3，p《0.05)。
[0137]
综上所述，多肽pp1可显著降低lps诱导的fhc细胞凋亡，但其本身单独作用并不影响正常fhc细胞的增殖，并且相较于对照肽scr，多肽pp1能显著降低nec模型细胞中tnf-α和il-6的mrna水平，表明多肽pp1能够有效地降低lps引起的炎症因子释放，缓解nec模型细胞炎症。
[0138]
实施例2pp1对nec动物模型的影响
[0139]
1.实验动物
[0140]
从南京医科大学动物实验中心购得spf级新生sd大鼠及其母鼠，将其饲养于南京医科大学实验动物中心，饲养条件为每12h进行一次光暗交替，室温24℃，湿度50％。
[0141]
2.实验分组
[0142]
设置con组、nec组、nec+scr组和nec+pp1组。
[0143]
3.实验方法
[0144]
3.1nec动物模型构建
[0145]
将出生24h内体重在6-9g的新生sd大鼠随机分为四组：
[0146]
con组：将新生sd大鼠与其母鼠同笼，进行母乳喂养；
[0147]
nec组：将新生sd大鼠每8h缺氧窒息一次(条件为：5％o2，95％n2，5min)，在每次缺氧结束后的2min内完成高渗奶(惠氏1段奶粉：雅培出生幼犬奶粉2:1，50μl/mg)灌胃，并且在早晚分别将本组新生sd大鼠放至4℃恒温箱内冷刺激5min；
[0148]
nec+scr组：实验方法与nec组相同，不同之处仅在于在每天灌胃的高渗奶配方中添加对照肽scr(2mg/kg)；
[0149]
nec+pp1组：实验方法与nec组相同，不同之处仅在于在每天灌胃的高渗奶配方中添加多肽pp1(2mg/kg)。
[0150]
经上述处理后，向每组存活大鼠的腹腔注射brdu(50mg/kg)，2h后统一以脊椎脱臼法处死大鼠，解剖胃肠道组织，注意操作轻柔，取距回肠末端2cm的近端肠组织为样本。
[0151]
3.2h&e染色
[0152]
h&e染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，由于组织或细胞的不同成分对苏木素的亲和力不同及染色性质不一样，经苏木素染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，处理适宜可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色，再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色，故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。
[0153]
具体步骤如下：
[0154]
(1)h&e染色：将肠道组织切片用苏木素染色5min后，蒸馏水冲洗干净；
[0155]
(2)饱和碳酸锂浸泡返蓝l min；
[0156]
(3)用0.5％伊红液浸染4～7min，蒸馏水漂洗干净；
[0157]
(4)利用乙醇梯度处理(80％乙醇脱水5s
→
95％乙醇脱水2min
→
100％乙醇脱水2min)，二甲苯浸泡2次，每次4min，最后用中性树胶封片。
[0158]
3.3rna提取
[0159]
(1)样品准备：
[0160]
动物组织取样完成后，加入1ml trizol和灭菌的小钢珠，置于匀浆器中，调整振荡频率为6.0hz，匀浆30s，使样本成为组织匀浆；
[0161]
(2)动物组织充分研磨后静置5min，将混合液转移至1.5ml无核酶ep管中并做好标记；
[0162]
(3)加入200μl氯仿颠倒数次混匀，室温静置5min，在离心力为12000g、温度为4℃条件下离心15min；
[0163]
(4)小心地转移上层水相400μl至新的无核酶ep管中，加400μl等量异丙醇颠倒混匀，室温静置10-20min，在离心力为12000g、温度为4℃条件下离心10min，弃上清；
[0164]
(5)加入1ml冰冷的depc水配置的75％乙醇，在离心力为7500g、温度为4℃条件下离心5min，弃上清；
[0165]
(6)室温10min晾干，用depc或无核酶水溶解吹打混匀，rna的浓度及纯度用nanodroptm2000测定。
[0166]
3.4实时荧光定量pcr(rt-qpcr)
[0167]
步骤同实施例1“实时荧光定量pcr(rt-qpcr)”项下步骤。
[0168]
4.数据及统计学处理
[0169]
采用spss20.0统计分析软件分析，计量资料以均数
±
标准差表示，两样本均数之间的比较，经正态性检验和方差齐性分析后，选择t或t'检验，p《0.05表示差异具有统计学意义。
[0170]
5.实验结果
[0171]
5.1pp1减轻nec动物模型大鼠肠坏死、肠出血和肠绒毛结构损伤，并且降低炎症因子水平
[0172]
体式显微镜拍摄结果显示，nec组构建的nec动物模型中大鼠肠道明显出血、坏死，现黄绿色稀便，表明模型构建成功。与nec+scr组相比，nec+pp1组使用多肽pp1干预(每天3次，每次2mg/kg，一共3天)能显著减轻肠损伤，恢复肠组织形态(图4)。
[0173]
h&e染色结果显示，nec组构建的nec动物模型中大鼠的肠上皮细胞明显减少，绒毛脱落，表明模型构建有效。与nec+scr组相比，nec+pp1组使用多肽pp1处理后，肠上皮细胞生长恢复，结构趋于完整，且炎症细胞浸润均明显减轻(图5)。
[0174]
rt-qpcr结果显示，nec组构建的nec动物模型中大鼠的tnf-α和il-6的表达相较于con组显著升高，表明模型构建成功。与nec+scr组相比，nec+pp1组使用多肽pp1处理后，大鼠血清中tnf-α和il-6的mrna水平显著降低(图6)，表明多肽pp1能够制nec大鼠的炎症反应。
[0175]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实
施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0176]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。