用于合成橄榄醇酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法与流程

1.本发明涉及合成生物技术领域，具体而言，涉及一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法。


背景技术：

2.蓝藻(cyanobacteria)可以进行厌氧型光合作用的大型单细胞原核生物，可以进行光合作用并以水为电子受体进行放氧。它的发展使整个地球大气从无氧状态发展到有氧状态，从而孕育了一切好氧生物的进化和发展。蓝藻作为碳固定场所，可以固定大气中的co2(一定程度上减轻co2过多引起的环境问题)。集胞藻pcc6803(synechocystis sp.pcc 6803)是一种单细胞球形蓝藻，能利用光能进行自养生长，又能利用葡萄糖进行异养生长。
3.蓝细菌(蓝藻，cyanobacterium，blue-green algae)是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有如下优势：(1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；(3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，许多种类的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。其中，集胞藻synechocystis sp.pcc6803是单细胞蓝细菌的代表物种，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合微生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一。
4.橄榄醇酸(ola)是一种来源于iii型聚酮合成酶(pks iiis)催化作用的植物次生代谢物，与其戊烯基化衍生物一起具有多种药理活性。单芳化合物橄榄醇酸(ola)是pks iii产品类的一员，具有抗菌、细胞毒性和光保护等药理活性。此外，橄榄醇酸是合成一类重要的药理化合物的中心中间体，因为它在大麻类化合物的生物合成过程中充当烷基间苯二酚部分，这类产品因其众多的药理性质而变得越来越重要。
5.目前，橄榄醇酸及其衍生物的生产主要是通过从植物中直接提取，但由于植物生长缓慢，这些化合物的积累至少需要几个月的时间，直接提取的周期较长。虽然植物生物技术提供了改善本地物种天然产物合成的机会，但精确控制转基因在植物中的表达水平并适应工业化生产是困难的。虽然橄榄醇酸的化学合成是最近报道的另一种选择，但大多数天然产物的结构复杂性决定了全化学合成固有的低效率，这导致了低产率和高能源浪费。与这些方法相比，建造微生物细胞工厂来生产这些增值的植物天然产物是一个很有前途的策略。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足，本技术首次成功地构建生物合成橄榄醇酸的蓝细菌所需的构建体。载体和菌株，并验证该构建方法具有良好的可行性，提供了一种在蓝细菌中生产
橄榄醇酸的方法，该方法具有产量高，无污染，生产周期短，成本低且环保的优点。
7.为解决上述问题，本发明提供一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的第一基因和第二基因，其中第一基因是丁烯酮合成酶基因和橄榄醇酸环化酶基因联合基因，其序列如seq id no.2所示，第二基因是酰基活化酶基因，其序列如seq id no.3所示。
8.可选地，其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。
9.可选地，所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如seq id no.4所示。
10.可选地，其在两端具有集胞藻pcc6803的slr0168基因的n-末端序列和c-末端序列，以用于同源重组。
11.可选地，在所述蓝细菌中具有活性的启动子为p
cpc560
。
12.可选地，所述蓝细菌为集胞藻pcc6803。
13.一种载体，其包含上述任一所述的用于合成橄榄醇酸的构建体。
14.包含上述任一所述的用于合成橄榄醇酸的构建体的蓝细菌。
15.用所述的载体转化的蓝细菌。
16.一种在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法，所述方法包括：在合适于合成橄榄醇酸的条件下培养上述蓝细菌；以及从所获得的培养物中提取所述的橄榄醇酸。
17.本发明合成橄榄醇酸与现有技术的不同之处在于：
18.1)本发明使用基因工程技术将橄榄醇酸合成的外源关键功能基因引入到集胞藻pcc6803基因组中，首次成功地在集胞藻pcc6803中构建了一条高效合成生物橄榄醇酸的代谢途径，在蓝细菌生长过程合成出橄榄醇酸。
19.2)本发明利用超强启动性的光强启动子p
cpc560
驱动来源于大麻毛状体的丁烯酮合成酶基因(tks)与橄榄醇酸环化酶基因(oac)在蓝细菌中一个和多个基因位点高效表达，提高橄榄醇酸的产量。
20.3)首次以蓝细菌为底盘生物进行改造合成橄榄醇酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低。
21.4)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本发明工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。
附图说明
22.图1为本发明实施例中质粒pmdslr0168的基本结构图；
23.图2为本发明实施例中重组质粒pmdslr0168-ω的基本结构图；
24.图3为本发明实施例中重组质粒pmd0168的基本结构图；
25.图4为本发明实施例中重组质粒pmd0168-tks/oac的基本结构图；
26.图5为本发明实施例中重组质粒pmd-tks/oac/aae的基本结构图；
27.图6为本发明实施例中蓝细菌生物合成橄榄醇酸的代谢流程；
28.图7为本发明实施例中蓝细菌生成的橄榄醇酸的hplc检测图；
29.图8为14天培养周期内本发明实施例中蓝细菌与野生型蓝细菌的生长情况对比图。
具体实施方式
30.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
31.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本文中所涉及的菌株培养，分子生物学，分子遗传学等操作步骤均为相应领域内广泛的常规步骤。同时为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
32.如本发明中所使用的“蓝细菌(cyanobacteria)”是一类光和自养的原核微生物，其能够利用太阳能固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝细菌，在发明中，蓝细菌和蓝细菌可以互换使用。本发明中所使用的蓝细菌为集胞藻 pcc6803。
33.如本发明中所使用的“丁烯酮合成酶(tks)”它催化己酰-辅酶a引物和3个丙二酰辅酶a延伸单元通过脱羧克莱森缩合反应生成3，5，7-三氧碘癸酰-辅酶a。
34.如本发明中所使用的“橄榄醇酸环化酶(oac)”通过c2-c7分子内的羟醛缩合反应将3，5，7-三氧碘癸酰-辅酶a中间体环化形成橄榄醇酸。
35.如本发明中所使用的“酰基活化酶(aae1)”是能够将己酸催化成为己酰辅酶a的酶。
36.如本发明中所使用的p
cpc560
启动子是指集胞藻pcc6803基因组中编码催化光合作用中卡尔文循环的第一个反应的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，rubisco)的操纵子的启动子(seq id no.1)p
cpc560
启动子在蓝细菌中具有活性。
37.如本发明中所使用的slr0168基因(例如参见nc_954899)是集胞藻 pcc6803基因组中编码一个未知蛋白的基因。大量的研究证明slr0168基因的缺失对蓝细菌的生长活动没有影响。该基因所在位置是一个中性位点。
38.本发明的详细方案如下：
39.本发明实施方案的一个目的就是在蓝细菌pcc6803中构建一条合成生物橄榄醇酸的代谢途径，将丁烯酮合成酶基因(tks)与橄榄醇酸环化酶基因(oac)以及酰基活化酶基因(aae1)，导入蓝细菌细胞得到重组蓝细菌细胞，利用重组蓝细菌细胞进行光合作用得到橄榄醇酸。
40.具体的，所述蓝细菌为集胞藻synechocystis sp.pcc6803。
41.不受任何理论束缚，结合图6所示，发明人认为在本技术中蓝细菌产生橄榄醇酸的机制如下：蓝细菌体内固碳经开尔文循环生成中间体丙酮酸。丙酮酸脱羧生成乙酰coa，乙酰coa在乙酰辅酶a羧化酶的催化下转化成丙二酰辅酶a，外源加入的己酸被酰基活化酶i(aae1)催化成己酰辅酶 a。丁烯酮合成酶(tks)催化己酰辅酶a和3个丙二酰辅酶a延伸单元通过脱羧克莱森缩合反应生成3，5，7-三氧碘癸酰-辅酶a。这个3，5，7-三氧碘癸酰-辅酶a中间体可以被橄榄醇酸环化酶(oac)通过c2-c7分子内的羟醛缩合反应环化，形成橄榄醇酸。
42.本发明实施方案的一个目的是高效启动丁烯酮合成酶，橄榄醇酸环化酶和酰基活
化酶并提高其活性，进而提高橄榄醇酸产量，实现利用蓝细菌高效合成生物橄榄醇酸的目的。
43.本发明实施方案是利用超强启动性的光强启动子p
cpc560
驱动丁烯酮合成酶，橄榄醇酸环化酶和酰基活化酶在蓝细菌中一个和多个基因位点表达。同时为了提高橄榄醇酸产量，构建合成生物橄榄醇酸的基因工程蓝细菌。
44.该合成方法具体包括以下步骤：
45.构建整合载体pmd0168:选取集胞藻pcc6803基因组上的slr0168基因序列作为外源基因整合位点，该基因序列的改变不会影响集胞藻pcc6803 整个基因组的功能，并在插入壮观霉素抗性基因(anti-spectinomycin，sper) 和超强启动子p
cpc560
,从而构建用于合成橄榄醇酸的整合载体pmd0168；
46.基因表达载体pmd-tks/oac/aae构建：根据集胞藻synechocystis sp. pcc6803的密码子偏好性，对来源于大麻毛状体的丁烯酮合成酶基因 (tks)、橄榄醇酸环化酶基因(oac)以及酰基活化酶基因(aae1)等基因序列进行密码子优化，然后将这三个密码子优化后的基因序列插入到上述构建的整合载体；
47.同源重组：将上述基因表达载体pmd-tks/oac/aae转入集胞藻pcc6803细胞内，通过同源重组将来源于大麻毛状体的丁烯酮合成酶基因 (tks)、橄榄醇酸环化酶基因(oac)、酰基活化酶基因(aae1)、壮观霉素抗性基因(anti-spectinomycin，sper)和超强启动子p
cpc560
等序列整合到集胞藻pcc6803基因组slr0168基因位点；
48.阳性转化子筛选：以壮观霉素来筛选转化pmd-tks/oac/aae载体后的集胞藻pcc6803单克隆细胞，然后提取该细胞基因组，通过pcr分子鉴定试验确定最终携带有丁烯酮合成酶基因(tks)、橄榄醇酸环化酶基因 (oac)、酰基活化酶基因(aae1)的转化子。
49.实施例1：构建光强超强启动子p
cpc560
质粒pmd-tks/oac/aae
50.以pmd18-t载体作为骨架序列，以提取的集胞藻pcc6803的基因组 dna为模板，分别用引物slr0168up-f和slr0168up-r、slr0168dw-f和 slr0168dw-r扩增slr0168上下游600bp基因序列，并分别连接到pmd18-t 的hindiii、sphi和kpni、ecori限制性内切酶位点之间，得到如图1所示的载体pmdslr0168。
51.以本实验保存的质粒pjs406(含壮观霉素抗性基因)为模板，采用引物spe-f与spe-r扩增壮观霉素抗性基因序列，并将扩增得到的基因片段插入到载体pmdslr0168的psti、xbai限制性内切酶位点之间，构建质粒 pmdslr0168-ω，质粒pmdslr0168-ω的基本结构如图2所示。
52.以集胞藻pcc6803的基因组dna为模板，采用引物对pcpc-f/pcpc-r 和trbcl-f/trbcl-r扩增得到的启动子(pcpc560)与终止子(trbcl)序列分别插入到pmdslr0168-ω的xbai、bamhi和bamhi、kpni位点之间，获得蓝细菌整合表达质粒pmd0168，质粒pmd0168的基本结构如图3所示。
53.根据集胞藻pcc6803的密码子偏好性，利用在线软件(http://www.jcat.de/)对来源于大麻毛状体中的丁烯酮合成酶基因(tks)、橄榄醇酸环化酶基因(oac)和酰基活化酶基因(aae1)的核苷酸序列进行优化，优化的序列由生工生物技术公司(中国上海)合成。以优化的合成菌株为模板，分别采用引物对tks-f/tks-r，aae-f/aae-r进行pcr扩增，扩增获得的基因序列片段插入到质粒pmd0168的启动子(p
cpc560
)与终止子(trbcl)之间，从而获得蓝
细菌整合表达质粒pmd-tks/oac/aae，其基本结构如图4所示。具体构建质粒和引物见表1，2所示。
54.表1本文所用到质粒
[0055][0056]
表2本文所用到的引物
[0057][0058]
实例2：蓝细菌的转化以及转化子的筛选
[0059]
1、转化集胞藻pcc6803及抗性传代
[0060]
集胞藻pcc6803具有天然dna转化系统，可以进行自然转化，通过同源双交换的方式实现基因重组，并整合到基因组中，在本实施例中通过自然转化实现基因敲除的目的。具体的转化过程及抗性传代流程如下：
[0061]
(1)取处于对数生长期(od730约为0.6-0.8)的新鲜蓝细菌细胞30ml， 4500rpm，15min离心收集细胞；用新鲜的bg11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1ml bg11培养基(1.5g l-1
nano3，40mg l-1
k2hpo4·
3h2o， 36mg l-1
cacl2·
2h2o，6mg l-1
柠檬酸，6mg l-1
柠檬酸铁铵，1mg l-1 edta二钠盐，20mg l-1
naco3，2.9mg l-1
h3bo3，1.8mg l-1
mncl2·
4h2o，0.22mg l-1
znso4·
7h2o，0.39mg l-1
namoo4·
2h2o，0.079mg l-1
cuso4·
5h2o 和0.01mg l-1
cocl2·
6h2o)中。
[0062]
(2)取0.2ml细胞悬液于新的ep管中，加入2～3μg表达质粒，混匀，并置于30℃、30μem-2s-1光照条件下温育18小时。
[0063]
(3)将蓝细菌细胞与dna的混合物涂布于铺在bg11平板(未加抗生素)上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μem-2s-1光照条件下培养24 小时。然后将硝酸纤维素膜转移到含有与目的藻株相应的抗生素的bg11 平板上，倒置于光照培养箱中。
[0064]
(4)培养10左右天后，可得到转化后的单菌落，将转化子从平板上挑出，在新鲜的bg11固体培养基(含壮观霉素)上划线；待细胞富集后，再将它们接入到液体bg11培养基(含壮观霉素)中进行培养。
[0065]
(5)将经转化的蓝细菌细胞在液体bg11培养基(含壮观霉素)中转接两次到三次，并且在通过基因组测序验证目的构建体的正确导入后，确定当前藻株为目标突变株。
[0066]
(6)取1ml的目标蓝细菌突变株进行接种培育，并在含有相应抗性的 bg11培养液中加入4mm的己酸钠，待突变株蓝细菌生长旺盛后将其用于检测橄榄醇酸的产量。
[0067]
2、菌株(藻株)、质粒培养
[0068]
集胞藻pcc6803在bg11培养液中培养，条件28～30℃和光照条件下 (30μe/m2
·
s)静置培养。bg11培养液中另外含有10μg ml-1
的壮观霉素和 5mm的葡萄糖，所有溶液均用去离子水配置制，根据需要添加不同浓度的铜离子。所有器皿均为塑料器皿。
[0069]
e.coli dh5α在37℃lb培养基中培养，含有质粒的大肠杆菌菌株中加入相应的抗生素(壮观霉素、硫酸卡那霉素、氨苄青霉素工作浓度均为50μg/ ml)。
[0070]
经过上述步骤转化集胞藻pcc6803，构建得到以下菌株：
[0071]
蓝细菌syn015：通过将质粒pmd-tks/oac/aae转化至集胞藻 pcc6803得到，由于该质粒中含有slr0168上下游600bp的同源序列，因此通过发生同源重组，通过双交换将pmd-tks/oac/aae中slr0168上下游片段间的pcpc560-spe
r-tks/oac/aae-trbcl整合到集胞藻pcc6803中 slr0168基因位点上。随后通过抗性筛选，将含有壮观霉素抗性的转化子进行培养并pcr验证，将验证正确的菌株编号为syn015。
[0072]
实例3：转基因蓝细菌的验证和产物的检测过程
[0073]
挑取10个左右含有10ug/ml壮观霉素bg11固体培养基上长出来的单克隆蓝细菌菌斑，接入5ml 10ug/ml壮观霉素bg11液体体培养基中培养，待蓝细菌培养好后，提取基因组，以设计好的引物pcr验证tks/oac和 aae两个目的基因，并pcr将产物送测序，确定基因序列是否正确，将验证正确的转tks/oac基因和aae基因的pcc6803蓝细菌接入100mlbg11液体培养基中光照培养，待od
730
大于或等于1时，添加底物己酸钠。在aae基因表达作用下，将己酸催化为己酰辅酶a，最后由基因tks/oac 的表达，以蓝细菌自身光合作用产生的丙二酰辅酶a和己酰辅酶a为底物合成橄榄醇酸，然后取诱导后培养的转基因蓝细菌，用超声细胞破碎仪破碎蓝细菌细胞，对产物分离提纯后，用高效液相色谱仪检测，检测结果如图7所示。
[0074]
实例4：橄榄醇酸产量分析结果
[0075]
新鲜的突变株蓝细菌样品经过细胞破碎，用乙酸乙酯进行萃取，待样品氮吹浓缩后上样高效液相色谱仪。高效液相色谱条件：流动相分别为乙腈和0.1％的甲酸水溶液，其中a相为乙腈，b相为0.1％甲酸水溶液。流速 1.0ml/min；0-2min,10％a和90％b；2-20min,10％a和90％b；20-25min，90％a 和10％b。检测波长为262nm，柱温35℃。经检测发现该蓝细菌突变株合成橄榄醇酸的产量为1.52mg/l。
[0076]
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。