一种蝙蝠蛾拟青霉S2在茶叶种植上的应用方法与流程

一种蝙蝠蛾拟青霉s2在茶叶种植上的应用方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蝙蝠蛾拟青霉s2在茶叶种植上的应用。


背景技术：

2.冬虫夏草为我国传统的名贵中药，味甘、性平、归肾、肺经。具有补肺阴、补肾阳、精益气、补虚损、止咳化痰，常用于咳嗽、咯血、阳痿，遗精、腰膝酸软、病后体虚症。近代药化药理研究证明，冬虫夏草主要药理成分是腺苷、尿苷、虫草素、虫草酸、甾醇、肽。具有降血脂、抗癌，防止动脉硬化，提高机体免疫力、抗疲劳、改善肾功能不全等功效。
3.近年来，国内外许多单位从野生冬虫夏草中分离出多种药用真菌，如中华被毛孢，蝙蝠蛾拟青霉，并用生物发酵技术培养发酵冬虫夏草菌而获得大量的冬虫夏草菌培养物，其主要药物成分与天然的冬虫夏草相似，中国药典2007年、 2010年、2015年、2018年药典收载了中华被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌的培养物，用中华被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌的培养物在制成的百灵胶囊和金水宝的药物，应用于咳嗽、咯血、阳痿，遗精、腰膝酸软、病后体虚症的临床治疗。中国发明专利cn201210485017.1，一种冬虫夏草保健产品及其制备方法，中国发明专利cn201310277019.6一种冬虫夏草菌粉药酒及其制备方法和中国发明专利 cn201210257893.4一种冬虫夏草保健酒及其制备方法，cn201510488835.7一种养生保健冬虫夏草酒及其制备方法，公开了冬虫夏草菌作为保健品的应用。
4.这些年来也有一些研究涉及冬虫夏草作为饲料添加剂的应用，cn1079204c 虫草属真菌饲料添加剂及其生产方法，cn1348703一种冬虫夏草菌粉类绿色饲料添加剂，cn1013381615b生产冬虫夏草饲料添加剂及其产品，用液体或固体浅盘发酵大量培养从冬虫夏草分离得到虫草属真菌生产虫草菌丝，制备成饲料添加剂。然而，鲜见冬虫夏草菌在茶叶种植上的应用。


技术实现要素：

5.根据现有技术的缺陷，本发明开拓一种冬虫夏草菌发酵物的新用途，提供一种在茶叶种植中应用冬虫夏草菌发酵物提高茶叶产量和品质的方法,是通过如下技术方案实现的。
6.一种蝙蝠蛾拟青霉s2在茶叶种植上的应用方法，采用从冬虫夏草菌分离的保藏编号为cctcc no：m2021317的蝙蝠蛾拟青霉s2的培养发酵物，应用于茶叶种植。
7.所述蝙蝠蛾拟青霉s2在含有碳源、氮源和无机盐的培养基中，培养发酵得到的培养发酵物并应用于茶叶种植过程中。
8.所述蝙蝠蛾拟青霉s2培养发酵物的制备，包括如下步骤：
9.将蝙蝠蛾拟青霉s2的菌种接种到种子培养基中，在22-25度，转速为 180-200r/min的摇瓶中培养38-46小时，得到种子液，所述种子液的菌体浓度 0.9-1.2g/100ml，摇瓶容量150ml/500ml；
10.将摇瓶培养得的种子液按液体体积比10-15％的比例接种到液体发酵培养基中，
在温度21-25度，转速为180-200r/min的条件下培养32-44小时，得到蝙蝠蛾拟青霉s2发酵液；
11.按照蝙蝠蛾拟青霉s2发酵液体积，加入42-95％乙醇使蝙蝠蛾拟青霉s2发酵液的乙醇含量为8-30％，经100mpa压力下均质处理，然后进行超声波处理，最后向超声波处理后的蝙蝠蛾拟青霉s2发酵液加入醋酸，搅匀使溶液的酸碱ph 值为3.6-4.4，得到蝙蝠蛾拟青霉s2培养发酵物的制剂。
12.所述种子培养基的组成以葡萄糖、糊精、淀粉为碳源、蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉为氮源，以mgso4、kh2po4为矿物元素。
13.所述液体发酵培养基组成为：葡萄糖0.8-1.2％、糊精1-1.5％、淀粉0.6-1.0％、蛋白胨0.9-1.5％、豆饼粉0.5-1.0％、蚕蛹粉0.7-1.3％、mgso40.05-0.07％、 kh2po40.08-0.13％。
14.本发明的有益效果是：
15.1、蝙蝠蛾拟青霉s2的发酵产物可显著提高茶叶的抽芽率和提高茶叶的产量，也可以提高茶多酚的含量，开拓了冬虫夏草菌的新用途。
16.2、制备蝙蝠蛾拟青霉s2需要使用的原材料种类少，用量低，来源方便，培养和发酵周期短，成本低，可借用普通的常见发酵设备，易于实现工业化生产。
17.3、目前的茶叶生产过程中，往往是通过改善种植的施肥方法和用量，或采用施用生长发育调节剂，而冬虫夏草蝙蝠蛾拟青霉s2是从冬虫夏草分离得到，其发酵产物对人体无毒无害，是一种安全绿色有机产品，为种植绿色有机茶叶提供了一种新的选择方法。
具体实施方式
18.以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
19.在本发明的实施例中，实验采用的冬虫夏草菌是从青海省玉树地区的野生天然新鲜的冬虫夏草中，表面消毒后，经反复分离纯化获得的冬虫夏草药用真菌s2，经菌落形态，显微特征和rrna基因its2-5.8s-1ts2区序列测定结果，来源于青海玉树地区冬虫夏草菌s2为蝙蝠蛾拟青霉paecilomyceshepialid，已保藏于武汉大学中国典型微生物保藏中心，保藏编号是cctcc no:m20211317。
20.冬虫夏草菌蝙蝠蛾拟青霉s2培养发酵物的制备通过以下步骤进行：
21.将蝙蝠蛾拟青霉菌s2菌种接种到以葡萄糖、糊精、淀粉为碳源，蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉为氮源，mgso4、kh2po4为矿物元素的种子培养基中，然后在 22-25度，转速为180-200r/min的摇瓶中培养38-46小时，得种子液，菌体浓度0.9-1.2g/100ml，摇瓶容量150ml/500ml。
22.将摇瓶培养得的种子液按液体体积比10-15％的比例接种到液体发酵培养基中，培养基组成为：葡萄糖0.8-1.2％、糊精1-1.5％、淀粉0.6-1.0％、蛋白胨 0.9-1.5％、豆饼粉0.5-1.0％，蚕蛹粉0.7-1.3％，mgso40.05-0.07％、 kh2po40.08-0.13％，然后在温度21-25度，转速为180-200r/min的条件下培养 32-44小时，得蝙蝠蛾拟青霉s2发酵液。
23.按照蝙蝠蛾拟青霉s2发酵液体积，加入适量的42-95％乙醇使s2发酵液的乙醇含量为8-30％，经100mpa压力下均质处理，然后再超声波处理，最后向超声波处理液加入适量
13％，在4-7度的冰箱内冷却，用超声波提取机在转速3r/min，功率35khz条件下超声提取35min，再加入食醋调整s2发酵物的ph至3.8-4.2。
35.实施例二
36.蝙蝠蛾拟青霉s2培养发酵物对发芽的促进作用：试验设计按肥料试验过程制定统一试验方案进行，区组设计共设计四个处理，每个处理重复2次，试验地小区总面积为5亩。试验分a、b、c、d四个处理组，其中，处理组a为空白对照组，施用清水，试验组b为蝙蝠蛾拟青霉s2发酵制剂的30倍稀释液，试验组c为蝙蝠蛾拟青霉s2发酵制剂60倍稀释液，试验组d为蝙蝠蛾拟青霉s2100 倍稀释液。
37.试验地选择四川茶叶生产区，土壤肥力均匀，土壤ph值5.3，有机质含量为27，全氮0.19，碱溶氮125，全磷0.65，有效磷25，全钾13.6，速效钾139，有良好的浇水设施，试验茶树为当地主种品种，试验期内，试验地块的田间管理如施肥，灌溉和病虫富防治按大田的常规管理进行。
38.试验数据采集与处理：按照常规试验方法进行，即在试验地的划定区块内，先用随机抽样方法，调查4块，每块1平方尺，调查茶叶抽芽数，并计量百芽重，在茶叶盛萌发期，每周调查一次，调查得到的调查数据按一般数学方法进行数据统计分析，结果见表1。
39.表1 s2发酵物对盛发期茶叶发芽的作用
[0040][0041]
实施例三
[0042]
蝙蝠蛾拟青霉s2培养发酵物对茶叶产量和茶叶质量的影响：实验设计和方案，基本按实施例2的方案进行。
[0043]
试验设计按肥料试验过程制定统一试验区组设计方案，共设计四个处理，每个处理重复2次，试验地小区总面积为5亩。试验分a、b、c、d四个处理组，其中，处理组a为空白对照组，施用清水，试验组b为蝙蝠蛾拟青霉s2发酵制剂的30倍稀释液，试验组c为蝙蝠蛾拟青霉s2发酵制剂60倍稀释液，试验组 d为蝙蝠蛾拟青霉s2100倍稀释液。
[0044]
试验地选择四川生产区，土壤肥力均匀，土壤ph值5.3，有机质含量为27，全氮0.19，碱溶氮125，全磷0.65，有效磷25，全钾13.6，速效钾139，有良好的浇水设施，试验茶树为当地主种品种，试验期内，试验地块的田间管理如施肥，灌溉和病虫富防治按大田的常规管理进行。
[0045]
试验数据采集与处理：按照常规试验方法进行，即在试验地的划定区块内，先用随机抽样方法，调查4块，每块1平方尺，按一芽一叶的采集标准采集此划定试验区块内的新萌发茶叶，称重，计量，在茶叶盛萌发期，每周调查一次，得到的调查数据按一般数学方法进行
数据统计分析，结果见表2-3。
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表2 s2对茶叶产量增加的作用
[0047][0048]
表3 s2对茶叶化学成分的影响
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处理水浸出物％变化率％茶多酚％变化率％游离氨基酸％变化率％咖啡碱％变化率％ck40.1 10.9 4.9 3.9 100倍稀释液40.7+1.4％13.2+12.1％5.1+4％4.0+2.5％70倍稀释液40.8+1.7％14.0+28.4％5.38.2％4.1+5％30倍稀释液42.3+5.5％15.7+44％5.716.3％4.2+7.7％
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以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。