一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用的制作方法

一种抗猪圆环病毒2型cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗猪圆环病毒2型cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用。


背景技术：

2.猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，pcv2)是导致猪圆环病毒相关疾病的主要病原，诱发断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸道综合征、猪皮炎肾病综合征和母猪繁殖障碍等疾病。pcv2损伤感染猪机体免疫系统，导致严重免疫抑制，进而诱发与细小病毒、猪肺炎支原体等多种不同病原体的协同或继发感染，严重影响对相关疾病的诊断和治疗。多年来pcv2在我国规模化养猪场中广泛存在，已经成为制约我国养猪业的三大疫病之一，对我国生猪养殖业造成严重经济损失。pcv2感染后尚无特效治疗药物，当前接种疫苗仍是防控该病的有效手段。
3.目前商品化的pcv2疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗以及杆状病毒载体灭活疫苗等三种类型。这三种类型的疫苗在抗原制备难易程度、存储条件、免疫保护效果和生产成本等方面各有优缺点。从实际应用效果来看，不同品牌的pcv2疫苗都能起到一定的免疫保护作用，但其在疫苗毒株、抗原含量及来源、佐剂种类等方面存的差异导致免疫效果不尽相同。另一方面，随着分子生物学技术的发展，抗体药物已经成为生物药物最具潜力的产业之一，在动物疫病的诊断和治疗方面起着越来越重要的作用。抗体类试剂的应用为 pcv2的防控提供了新的选择方向。
4.已有多种基于单克隆抗体的诊断试剂、免疫抑制剂或治疗药物用于病原体的诊断以及免疫性疾病和病毒感染等的治疗。此外，针对不同肿瘤抗原的单克隆抗体结合相应的标记技术也早已用于临床实践中。单克隆抗体虽然在病原检测、疾病诊断和治疗等方面应用潜力巨大，但在某些应用条件下仍存在许多不足：较大的相对分子质量限制了其组织穿透能力；在机体内可引起免疫反应，进而被当做外来抗原被机体清除；生产制备过程复杂，生产成本高等。过高的使用成本限制了传统单克隆抗体在畜牧兽医领域作为治疗药物及其他形式的大规模应用。
5.迄今为止，国内外已有许多学者进行了pcv2单克隆抗体的制备和应用研究，但是由于成本等因素，pcv2相关的单克隆抗体目前主要作为诊断试剂使用。hamers等发现在骆驼外周血中存在一种天然缺失轻链的重链抗体 (heavy-chain antibodies，hcabs)，此后在羊驼等驼科动物、护士鲨等鱼类体内也发现存在类似抗体。通过克隆骆驼科动物hcabs重链可变区，可得到只包含一个重链可变区的单域抗体(variable domain of the heavy chain of hcab， vhh)，这是目前已知具有抗原结合活性且结构稳定的最小抗体单位。其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，相对分子质量约15kda，仅为常规抗体的1/10，因此又被称为纳米抗体(nanobody，nb)，为抗体小型化提供了新的研究方向。相对于传统的单克隆抗体而言，nb具有相对分子质量小、结构稳定、可溶性极高，不易聚集，能耐强酸、强碱等致变性条
件、能识别独特的小表位、亲和活性高、组织穿透能力强等优点。nb许多方面均优于传统抗体，在治疗性抗体药物研发、临床体外诊断、免疫学研究等领域具有很大的应用前景。
6.尽管纳米抗体有上述优点，但在临床应用过程中也存在半衰期短、有效性相对较低等不足。多价抗体是识别同种或不同表位的单价抗体的聚合物，比单价抗体具有更高的抗原亲和活力，并且能够显著延长在体内的半衰期，因此具有更广泛的功能和用途。传统全分子抗体由于结构复杂、二硫键多，在体内精确组装和体外纯化等方面的困难限制了双特异性全分子抗体的开发应用。而 nb因其结构简单、易于通过分子生物学方法对其进行改造，容易被开发成双价或双特异性纳米抗体，并且易于通过原核或真核表达系统进行大量制备，能够极大降低生产成本。
7.因此，纳米抗体及基于纳米抗体改造的双价纳米抗体具有传统单克隆抗体无可比拟的优势，制备抗pcv2 cap蛋白的双价中和纳米抗体能够为猪圆环病毒病的及时治疗提供大量廉价、特异性高、稳定性好的优质抗体。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种抗猪圆环病毒2型cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用，该抗pcv2 cap蛋白的纳米抗体能充分发挥纳米抗体的优异性能，其双价中和纳米抗体既具有优异的特异性抗原结合能力，又具有稳定的pcv2 病毒中和活性；在猪圆环病毒相关疾病防治、尤其是在pcv2感染后作为治疗药物中的应用具有广泛价值，解决了现有技术中存在的问题。
9.本发明所采用的技术方案之一是：
10.一种抗猪圆环病毒2型cap蛋白纳米抗体，其可变区具有3个互补决定区 cdr1、cdr2、cdr3，其中，cdr1序列由seq id no.1所示的氨基酸序列组成、cdr2由seq id no.2所示的氨基酸序列组成、cdr3由seq id no.3 所示的氨基酸序列组成。
11.优选的，所述纳米抗体序列由seq id no.4所述氨基酸组成。
12.本发明所采用的技术方案之二是：
13.一种编码如上所述的抗猪圆环病毒2型cap蛋白纳米抗体的核苷酸，所述核苷酸序列由seq id no.5所示。
14.本发明所采用的技术方案之三是：
15.上述抗猪圆环病毒2型cap蛋白纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
16.(1)使用pcv2全病毒灭活疫苗、pcv2病毒样颗粒(vlp)疫苗和pcv2 基因工程亚单位疫苗分别通过背部皮下多点注射方式免疫3只羊驼；
17.(2)采集免疫后羊驼外周血，分别获得来自3只羊驼的淋巴细胞；
18.(3)将步骤(2)所述得到的淋巴细胞进行总rna提取，反转录制备cdna，使用引物vhh1-f和vhh1-r对cdna进行扩增，得到vhh基因片段；以第一轮pcr产物为模板，使用引物vhh2-f和vhh2-r进行第二轮pcr反应，其中引物vhh1-f和vhh1-r的序列分别如seq id no.8和seq id no.9所示，引物vhh2-f和vhh2-r序列分别如seq id no.10和seq id no.11；
19.(4)将步骤(3)所述得到的vhh基因片段连接入表达载体，并转化至感受态细胞，构建抗体免疫库；
20.(5)将来自步骤(2)所述3只不同羊驼的淋巴细胞分别按步骤(3)和 (4)进行处理，
分别构建抗体免疫库；
21.(6)将步骤(4)所得抗体免疫库以pcv2病毒痒颗粒为包被抗原进行淘选，得到抗pcv2 cap蛋白特异性纳米抗体序列；
22.(7)验证抗pcv2 cap蛋白特异性纳米抗体与pcv2抗原结合及中和活性。
23.本发明所采用的技术方案之四是：
24.一种抗猪圆环病毒2型cap蛋白双价中和纳米抗体，由两个如上所述的纳米抗体串联而成；优选的，上述抗猪圆环病毒2型cap蛋白双价中和纳米抗体，由两个如seq id no.4氨基酸序列的纳米抗体串联而成；所述双价中和纳米抗体具有如seq id no.6所示的氨基酸序列。
25.优选的，组成所述抗猪圆环病毒2型cap蛋白双价中和纳米抗体的纳米抗体具有上述独特的cdr1、cdr2和cdr3区序列，能特异性结合pcv2 cap 蛋白，具有高度特异的识别和结合能力，且具有pcv2中和活性。
26.优选的，双价中和纳米抗体从n端到c端的结构如下式所示：
27.a-l-a；其中，
“‑”
为肽键，a为本发明所述具有cdr1、cdr2、cdr3组合特征的单价纳米抗体蛋白，l为无或柔性接头。
28.本发明所采用的技术方案之五是：
29.一种编码如上所述的抗猪圆环病毒2型cap蛋白双价中和纳米抗体的核苷酸，所述核苷酸序列由seq id no.7所示。
30.本发明所采用的技术方案之六是：
31.一种含有上述核苷酸序列的重组载体。
32.优选的，所述重组载体为pet32a。
33.一种含有所述的重组载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌 bl
21
(de3)。
34.本发明所采用的技术方案之七是：
35.如前所述的双价中和纳米抗体在制备猪圆环病毒2型预防和/或治疗药物中的应用。
36.本发明所采用的技术方案之八是：
37.一种多价纳米抗体的组合物，所述组合物包括下述纳米抗体的一个或多个：可变区由seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示氨基酸序列的纳米抗体。
38.优选的，所述组合物为由含seq id no.4或seq id no.6所示氨基酸序列组成的多价纳米抗体的组合物。
39.本发明的有益效果：
40.本发明的抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体，包含由linker连接的2个单价纳米抗体，其中单价纳米抗体具有独特的cdr1、cdr2和cdr3区域序列，对pcv2 cap蛋白具有高度特异的识别和结合能力，elisa效价可达 1:10000以上，显示出本发明提供的双价纳米抗体具有高度特异的结合活性。另外，本发明的双价纳米抗体能够通过与pcv2 cap蛋白的特异性结合，抑制 pcv2对pk-15细胞的感染，证明该双价纳米抗体还具有pcv2中和活性，抗 pcv2单价纳米抗体对pcv2中和效价为1:8，制备成双价纳米抗体后对pcv2 中和效价可达1:32。在预防和/或治疗pcv2感染中能够发挥有效的免疫保护作用，因而其在猪圆环病毒相关疾病的预防和/或治疗药物制备中具有很高的应用价值。
附图说明
41.图1为纳米抗体文库构建第一轮pcr扩增vhh基因电泳鉴定图；
42.图2为纳米抗体文库构建第二轮pcr扩增vhh基因电泳鉴定图；
43.图3为pcantab5e载体与vhh基因连接电泳鉴定图；
44.图4为菌液pcr鉴定转化子阳性率电泳结果图；
45.图5为phage-elisa鉴定阳性克隆结果图；
46.图6为不同免疫库来源的纳米抗体elisa效价和中和活性分析；
47.图7为pcr扩增单价抗pcv2纳米抗体基因片段电泳结果图；
48.图8单价纳米抗体重组表达载体构建菌液pcr鉴定电泳结果图；
49.图9为pcr扩增双价纳米抗体上游和下游片段电泳鉴定图；
50.图10为菌液pcr鉴定双价重组载体电泳结果图；
51.图11为重组载体双酶切鉴定电泳结果图；
52.图12为单价与双价纳米抗体原核表达sds-page鉴定图；
53.图13为单价纳米抗体纯化sds-page鉴定图；
54.图14为双价纳米抗体纯化sds-page鉴定图；
55.图15为双价纳米抗体与抗原结合活性elisa效价曲线图；
56.图16为单价纳米抗体与双价纳米抗体中和效价结果图。
具体实施方式
57.为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
58.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
59.实施例1羊驼免疫
60.1.1pcv2全病毒灭活疫苗免疫
61.选取健康成年羊驼1只，将pcv2全病毒灭活疫苗通过背部皮下多点注射方式对其进行免疫，共免疫4次，每次免疫间隔为14d；第4次免疫结束1周后，采集外周血50ml，用于构建噬菌体展示文库。
62.1.2pcv2-vlp疫苗免疫
63.选取健康成年羊驼1只，将pcv2-vlp重组蛋白1mg与等体积弗氏完全佐剂混合经乳化后通过背部皮下多点注射方式对羊驼进行免疫，首免14d后将 pcv2-vlp重组蛋白0.5mg与等体积弗氏不完全佐剂混合经乳化后以相同方式免疫羊驼；第4次免疫结束1周后，采集外周血50ml，用于构建噬菌体展示文库。
64.1.3pcv2基因工程亚单位疫苗免疫
65.选取健康成年羊驼1只，将pcv2 cap重组蛋白1mg与等体积弗氏完全佐剂混合经乳化后通过背部皮下多点注射方式对羊驼进行免疫，首重组蛋白 0.5mg与等体积弗氏不完全佐剂混合经乳化后以相同方式免疫羊驼；第4次免疫结束1周后，采集外周血50ml，用于构建
噬菌体展示文库。
66.实施例2抗pcv2纳米抗体免疫文库的构建
67.2.1淋巴细胞分离及总rna提取
68.通过密度梯度离心方法，按照本技术领域常规程序，从羊驼外周血中分离单个核淋巴细胞。利用血球计数板计数淋巴细胞，取1.0
×
107个活细胞提取总 rna，其余淋巴细胞-80℃冻存。
69.按照本技术领域常规程序从1.0
×
107个淋巴细胞中提取总rna，使用 nanodrop 2000测定浓度后用于反转录合成第一链cdna。
70.2.2反转录合成cdna
71.根据第一链cdna合成剂盒 (thermoscientificrevertaidfirststrandcdnasynthesiskit，k1621)说明书，以步骤2.1获得的总rna为模板，进行逆转录合成第一链cdna。
72.2.3抗体可变区基因扩增
73.利用巢式pcr，通过两轮pcr反应扩增羊驼重链抗体的可变区编码基因，第一链pcr反应以步骤2.2获得的cdna为模板，使用以下引物进行扩增反应：
74.vhh1-f：gtcctggctgctcttctacaagg
75.vhh1-r：ggtacgtgctgttgaactgttcc
76.pcr反应条件及程序为：94℃5min，94℃30s、50℃30s、72℃50s，30 个循环，72℃10min。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切取约700bp片段，使用胶回收试剂盒回收纯化目的片段。如图1所示：m为dl2000 dna marker， 1为第一轮pcr产物。以第一轮pcr产物为模板，以下述引物进行第二轮pcr 反应：
77.vhh2-f： tttctattactaggcccagccggccatggctcaggtgtggctcgtggagt c
78.vhh2-r：aaggaaaaaagcggccgcgccataatggcctggttgtg
79.pcr反应条件及程序为：94℃5min，94℃30s、60℃30s、72℃50s， 30个循环，72℃10min。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切取约400bp 片段，使用胶回收试剂盒回收纯化目的片段vhh。如图2所示：m为dl2000 dna marker；1为第二轮pcr产物；纯化产物-20℃保存备用。
80.2.4噬菌粒重组载体构建
81.将vhh目的基因片段与pcantab5e噬菌粒载体分别使用sfii和not i 限制性内切酶双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒进行回收纯化；使用t4 dna连接酶，将经双酶切处理后的vhh目的基因片段与pcantab5e 噬菌粒载体连接。1％琼脂糖凝胶电泳检测连接效果，如图3所示：m为1kbdnaladder；1为pcantab5e噬菌粒载体双酶切后产物；2为连接后产物。
82.2.5电转化及库容测定
83.将连接产物经电穿孔法转入新制备的e.colitg1感受态细胞(amidbiosciences，catalog#etg1-201)中，电穿孔仪(美国btxecm399)设置电压为1.8kv，电转化完成后37℃200r/min振荡培养1h，取100μl进行梯度稀释计算电转化效率；剩余菌液涂布氨苄抗性固体平板，30℃过夜培养。
84.使用lb培养基冲洗平板上固化的菌落并收集到250ml灭菌锥形瓶中，取100μl菌液进行梯度稀释后涂布氨苄抗性平板，过夜培养后计数各稀释度平板上的菌落数，根据菌落
数及稀释倍数计算抗体文库的库容；并随机挑取50个单菌落,分别于5mllb培养基中过夜培养，使用pcantab5-r1和 pcantab5-r2引物进行菌液pcr鉴定，如图4所示：m为dl2000 dna marker； ctrl为pcr阴性对照；1-50为随机挑选的单克隆菌液pcr鉴定产物。根据pcr 阳性结果推算库容(库容量＝克隆数
×
稀释倍数
×
pcr阳性率
×
10)。其中，引物pcantab5-r1和pcantab5-r2引物序列如下：
85.pcantab5-r1：ccatgattacgccaagctttggagcc
86.pcantab5-r2：cgatctaaagttttgtcgtctttcc
87.实施例3抗pcv2 cap特异性纳米抗体的淘筛及鉴定
88.3.1噬菌体扩增
89.将vhh与pcantab5e连接产物电转化至e.colitg1后即形成所述初级抗体库(步骤1.6)；取初级抗体库1支(1ml)，加入到250ml2
×
yt-g(2％葡萄糖)培养基中，37℃，250rpm，培养1h至od600约0.5，加入终浓度为 100μg/ml amp和moi＝20:1的辅助噬菌体m13ko7，37℃水浴轻摇30min，再 37℃摇床培养30min；4000rpm离心去上清弃上清后，用2倍体积(500ml) 2
×
yt-ak培养基悬浮细菌沉淀，37℃，220rpm，培养过夜；离心取上清，加 100ml的peg/nacl(peg为aladdin产品，cas 25322-68-3；nacl为上海国药产品，cas 7647-14-5)，4℃冰浴，不超过1h。8000rpm离心20min后弃上清，用5ml的2
×
yt培养基悬浮噬菌体沉淀，再次10000rpm离心15min，取上清备用。
90.将过夜培养的tg1，分装成500ml/管，将上述噬菌体进行10倍系列稀释，将倍比稀释的噬菌体分别与tg1培养物混合，然后37℃振荡培养30min，分别与0.7％琼脂液混匀后倾注2
×
yt固体培养基平板，37℃培养过夜。次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)：
[0091][0092]
3.2纳米抗体淘筛
[0093]
按照mpbs:上清＝2:3的比例将mpbs(含2％脱脂奶粉的pbs溶液)和上述噬菌体上清混匀，室温下放置20min；提前一天使用适宜浓度的pcv2 cap 蛋白包被elisa板，mpbs(含2％脱脂奶粉的pbs溶液)封闭，pbst洗涤。每孔中加入100μl上述处理后的噬菌体上清与mpbs混合物孵育2h，pbst 洗涤后向每孔中加入培养至对数期的宿主菌tg1(od
600
≈0.5)，100μl/孔， 37℃150rpm振荡孵育1h，收集菌液。至此第一轮淘洗结束，获得pcv2一级纳米抗体文库。
[0094]
向一级文库菌种加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素和2％的葡萄糖溶液，同时加入m13k07辅助噬菌体，孵育培养后离心弃上清，菌体沉淀使用 2
×
yt-ak培养液重悬，37℃220rpm培养过夜；通过4轮淘洗，把最终获得的噬菌粒重组菌液进行梯度倍比稀释，然后用移液枪各吸取100μl的各梯度相应的稀释液涂在sobag平板上，置于30℃电热恒温培养箱中，倒置培养 20-24小时；剩余菌液加入终浓度20％甘油后于-80℃冰箱冻存，标记为四级抗体库。
[0095]
3.3纳米抗体阳性克隆鉴定及phage-elisa鉴定
[0096]
从第四轮淘筛后稀释涂布的平板上挑取单菌落，接种于400μl2
×
ty-ag培养液中，37℃180rpm培养过夜；通过菌液pcr鉴定含有纳米抗体基因序列的阳性克隆，将阳性克隆菌
液置于96孔板中，标记为masterplate；另取新的无菌ep管，每管加入400μl含有2.5
×
10
10
pfu/mlm13k07的2
×
yt-ag培养基，标注为p1plate；masterplate板中的菌液每孔取40μl，加入到p1plate管中；将p1plate中的ep管置于气浴恒温振荡器中，37℃150rpm，振荡培养2h；离心后弃去上清；每管加入400μl2
×
yt-ak培养液重悬菌体沉淀，37℃，220rpm，振荡培养过夜；将过夜培养物7000rpm离心20min，上清转移至新无菌ep管中，4℃存放备用。
[0097]
按最佳包被浓度，将pcv2cap包被至96孔酶标板，100μl/孔，设立阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；4℃包被过夜。洗板后以2％的mpbs封闭；取160μl重组噬菌体与40μl2％mpbs混合均匀，室温条件下孵育20min；把孵育好的重组噬菌体加入到上述封闭后的酶标孔中，37℃孵育2h；pbst洗涤后每孔加入1:4000稀释的hrp标记抗m13鼠源单克隆抗体，37℃孵育1h；洗板后用tmb显色液，然后用1mh2so4溶液终止显色反应，于450nm处读取吸光值,如图5所示：bc-pc为阴性对照；1-94为纳米抗体阳性克隆elisa鉴定结果。
[0098]
3.4纳米抗体可变区氨基酸顺序及结构特征鉴定
[0099]
将phage-elisa鉴定为阳性的单克隆提取质粒，对重组质粒目的基因进行测序分析。结果显示，经四轮淘洗后获得的cap特异性纳米抗体序列各不相同，尤其是cdr3区的核苷酸序列均差异较大。
[0100]
通过抗pcv2全病毒纳米抗体噬菌体文库的构建、纳米抗体的淘筛、并将这些纳米抗体基因片段克隆至大肠杆菌进行原核表达，获得抗pcv2cap蛋白的纳米抗体后，分别对其进行中和活性鉴定，仅获得了1株具有pcv2活病毒中和活性的纳米抗体。将该株纳米抗体基因序列上传vbase2数据库(http://www.vbase2.org/vbdnaplot.php)，对pcv2中和纳米抗体进行氨基酸序列分析，以确定抗pcv2中和纳米抗体的互补决定区(complementarydeterminingregions，cdr)氨基酸组成及结构特征。
[0101]
该株具有pcv2中和活性纳米抗体的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列为:
[0102]
cdr1区氨基酸序列如seqidno.1所示，cdr2区氨基酸序列如seqidno.2所示，cdr3区氨基酸序列如seqidno.3所示；
[0103]
该株具有pcv2中和活性纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.4所示。
[0104]
实施例4来自3种不同抗原免疫文库的抗pcv2纳米抗体差异分析
[0105]
以pcv2-vlp重组蛋白作为抗原，分别对来自以pcv2全病毒灭活疫苗、pcv2-vlp疫苗和pcv2基因工程亚单位疫苗的免疫文库进行淘筛，共获得11种相互独立的抗pcv2纳米抗体序列。其中，从pcv2全病毒灭活疫苗免疫文库中淘洗获得4种不同序列的抗pcv2纳米抗体(nbvr-4、nbvr-20、nbvr-23、nbvr-67)，从pcv2-vlp疫苗免疫文库中淘洗获得5种相互独立的抗pcv2纳米抗体序列(nbvl-11、nbvl-18、nbvl-22、nbvl-55、nbvl-56)，从pcv2基因工程亚单位疫苗免疫文库中淘洗获得2种相互独立的抗pcv2纳米抗体序列(nbcp34、nbcp71)。
[0106]
将该11种抗pcv2纳米抗体序列编码基因扩增后克隆至原核表达载体，通过大肠杆菌原核系统进行制备，并分别验证其与pcv2cap蛋白的反应活性、与对pcv2的中和活性。
[0107]
结果显示，11种不同序列的抗pcv2纳米抗体在elisa测试中表现出不同的抗原反应活性，其中有1株nbvl-22来源于pcv2-vlp疫苗免疫文库的抗pcv2纳米抗体具有pcv2中和活性，中和效价为1:8，其他10株纳米抗体无中和活性(图6)。
[0108]
上述筛选的11种抗pcv2纳米抗体的elisa效价及中和活性如下表：
[0109][0110][0111]
实施例5抗pcv2中和纳米抗体的制备
[0112]
5.1引物设计及vhhs片段pcr扩增
[0113]
根据筛选得到的抗pcv2中和纳米抗体基因片段测序序列，设计一对特异性引物用于扩增纳米抗体重组基因序列，vhhcap-f和vhhcap-r分别含有saci和hindiii限制性内切酶酶切位点。重组质粒鉴定引物detc-f和detc-r为原核表达载体pet32a上的通用引物。vhh片段扩增及重组载体鉴定所用引物序列如下：
[0114]
vhhcap-f：cgagctcatggctcaggtgtggctcgtggagtc
[0115]
vhhcap-r：cccaagcttgccataatggcctggttgtg
[0116]
detc-f：ccagcacatggacagccc
[0117]
detc-r：gtggcagcagccaactcag
[0118]
以筛选获得的抗pcv2中和纳米抗体基因序列为模板，以引物vhhcap-f和vhhcap-r分别扩增纳米抗体基因片段。pcr反应参数为95℃5min，94℃30s、60℃30s、72℃30s，30cycles，72℃5min。
[0119]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图7所示。pcr产物-20℃保存，用于后续纳米抗体重组表达载体构建。
[0120]
5.2抗pcv2中和纳米抗体重组表达载体构建
[0121]
vhhcap片段与pet32a载体分别用saci和hindiii限制性内切酶进行双酶切，酶切产物分别纯化回收后经t4dna连接酶连接，转化至dh5α感受态细胞。通过菌液pcr方法对重组质粒进行鉴定(图8：m为dl2000dnamarker；nc为pcr阴性对照；1-5为重组载体pcr鉴定结果)并进行测序分析。测序正确的重组质粒命名为vhhcap-pet32a。
[0122]
5.3抗pcv2中和纳米抗体的表达
[0123]
重组质粒转化e.colibl21(de3)感受态细胞；按1:100比例，接种于50μg/mlamp
的600ml lb培养液中，37℃220rpm振摇至菌体od600为0.5-0.8；发酵培养基中加入诱导剂iptg至终浓度为0.1mm，160rpm于22℃培养5h； 5000rpm，4℃离心5min，离心去上清收集发酵菌体，-20℃保存；超声破碎菌体：150w功率，破碎1s，间隔1.5s，共20min，破菌缓冲液：pbs，ph7.4。表达结果如图12单价与双价纳米抗体原核表达sds-page鉴定图中泳道5-8：其中m为蛋白marker，泳道5为vhhcap-pet32a/bl21诱导超声破碎上清；泳道6为vhhcap-pet32a/bl21诱导超声沉淀；泳道7为vhhcap-pet32a /bl21未诱导超声破碎上清；泳道8为vhhcap-pet32a/bl21未诱导超声破碎沉淀，由此可知，蛋白正确表达且为可溶。
[0124]
5.4抗pcv2中和纳米抗体纯化
[0125]
破碎后的菌体12000rpm离心10min，4℃，收集上清进行镍柱纯化，填料类型为smart-ni。平衡液：pbs，ph7.4，洗脱液：pbs，250mm imidazole， ph7.4。结果如图13所示，其中m为蛋白marker，第4-8泳道为抗pcv2纳米抗体重组蛋白纯化结果，第3泳道为抗pcv2纳米抗体重组蛋白流穿液，第1 泳道为菌体超声破碎后离心沉淀，第2泳道为菌体超声破碎后离心上清，由此可知，镍柱纯化后目的蛋白纯度大于90％，且浓度较高。
[0126]
实施例6抗pcv2双价中和纳米抗体的制备
[0127]
6.1引物设计及vhhs片段pcr扩增
[0128]
根据筛选得到的抗pcv2中和纳米抗体基因片段测序序列，设计两对特异性引物分别用于扩增双价中和纳米抗体重组序列的上游vhhup片段和下游vhhdown片段。vhhup片段扩增引物vhhup-f和vhhup-r分别含有限制性内切酶bamh i和sac i酶切位点，其中linker基因序列作为引物的一部分包含在vhhup-r中；vhhdown片段扩增引物vhhdown-f和vhhdown-r分别含有sac i和hind iii限制性内切酶酶切位点。重组质粒鉴定引物detc-f和detc-r 为原核表达载体pet32a上的通用引物。vhh片段扩增及重组载体鉴定所用引物序列如下：
[0129]
vhhup-f：cgggatccatggctcaggtgtggctcgtggagtc
[0130]
vhhup-r：cgagctccgaaccaccgccaccactgccaccaccgccgc taccgccgccaccgccataatggcctggttgtg
[0131]
vhhdown-f：cgagctcatggctcaggtgtggctcgtggagtc
[0132]
vhhdown-r：cccaagcttgccataatggcctggttgtg
[0133]
detc-f：ccagcacatggacagccc
[0134]
detc-r：gtggcagcagccaactcag
[0135]
以筛选获得的抗pcv2中和纳米抗体nbvl-22基因序列为模板，以引物 vhhup-f/vhhup-r和vhhdown-f/vhhdown-r分别扩增双价纳米抗体重组序列的上游片段vhhcap-22-up和下游片段vhhcap-22-down。pcr反应参数为95℃5min，94℃30s、60℃30s、72℃30s，30cycles，72℃5min。
[0136]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，vhhup pcr产物片段比vhhdownpcr产物稍大(图9：m为dl2000 dna marker；1为vhhup pcr产物；2 为vhhdown pcr产物)。vhhup和vhhdown pcr产物-20℃保存，用于后续双价纳米抗体重组表达载体构建。
[0137]
6.2抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体重组表达载体构建
[0138]
vhhdown片段与pet32a载体分别用sac i和hindiii限制性内切酶进行双酶切，酶切产物分别纯化回收后经t4 dna连接酶连接，转化至dh5α感受态细胞。通过菌液pcr方法对
重组质粒进行鉴定并进行测序分析。测序正确的重组质粒命名为vhhdown-pet32a。
[0139]
vhhup片段与vhhdown-pet32a重组质粒分别用bamh i和sac i限制性内切酶处理，经t4 dna连接酶连接后转化dh5α感受态细胞。通过菌液pcr 方法(图10：m为dl2000 dna marker；ctrl为pcr阴性对照；1-6为双价纳米抗体重组表达载体菌液pcr鉴定结果)和双酶切(图11：m为dl5000 dnamarker；m1为dl2000 dna marker；1-2为双价纳米抗体重组质粒双酶切鉴定结果)鉴定重组质粒；对鉴定为阳性的重组质粒进行测序验证。测序正确的重组质粒命名为bivhhcap-pet32a。
[0140]
6.3抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体的表达与纯化
[0141]
将重组质粒bivhhcap-pet32a转化e.colibl21(de3)感受态细胞，挑取单菌落过夜培养，次日将过夜培养物接种至新鲜lb培养基中，待细菌达到对数生长期时加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导表达5h；同时将单价重组质粒 vhhdown-pet32a转化bl21(de3)感受态细胞，以相同条件进行诱导表达；以未诱导的bivhhcap-pet32a/bl21和vhhdown-pet32a/bl21在相同培养条件下的结果作为阴性对照。诱导表达后菌体细胞经超声波破碎，高速离心分离上清和沉淀，将双价和单价vhh表达产物分别进行sds-page分析。抗pcv2 cap 蛋白单价纳米抗体和双价纳米抗体在大肠杆菌原核表达系统中均实现了可溶性表达，参见图12：m为蛋白marker；1为bivhhcap-pet32a/bl21诱导菌超声破碎上清；2为bivhhcap-pet32a/bl21诱导超声破碎沉淀；3为 bivhhcap-pet32a/bl21未诱导超声破碎上清；4：bivhhcap-pet32a/bl21未诱导超声破碎沉淀；5为vhhcap-pet32a/bl21诱导超声破碎上清；6为 vhhcap-pet32a/bl21诱导超声沉淀；7为vhhcap-pet32a/bl21未诱导超声破碎上清；8为vhhcap-pet32a/bl21未诱导超声破碎沉淀。
[0142]
使用ni
2+
亲和层析柱对原核表达的双价及单价nbcap重组蛋白进行纯化，纯化后的抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体sds-page结果如图14所示(图 14：m为蛋白marker；1为bivhhcap-pet32a/bl21诱导表达超声上清；2为过柱流穿液；3-5为抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体重组蛋白纯化结果)。将纯化后双价binbcap和单价nbcap重组蛋白溶液稀释至1mg/ml，4℃保存备用。
[0143]
实施例7抗pcv2单价-双价中和纳米抗体与抗原的elisa效价测试
[0144]
以pcv2 cap蛋白作为抗原包被96孔酶标板，包被浓度为10μg/ml，每孔加入200μl 3％mpbs进行封闭，binbcap重组蛋白与nbcap重组蛋白分别调整至相同浓度水平后进行梯度稀释，分别以梯度稀释的抗pcv2 cap蛋白单价中和纳米抗体和双价中和纳米抗体重组蛋白作为一抗，设置空白对照和阴性对照，37℃孵育1h；洗涤后使用1:2000稀释的anti his-tag(hrp)鼠源单抗 37℃孵育1h；洗涤后加入tmb底物显色液室温显色15min，显色完成后加入终止液，酶标仪读取450nm波长处吸光值。结果显示表明：双价nb重组蛋白与抗原的结合活性较单价nb更强；以样本od450/阴性od450≥3作为阳性判定标准，cap特异性单价nb elisa效价约为1:500，而双价nb elisa效价为1:10000，双价nb的elisa效价比单价nb增加了20倍(图15)。
[0145]
实施例8抗pcv2单价-双价纳米抗体中和效价测定
[0146]
分别取纯化后的抗pcv2单价与双价中和纳米抗体，调整至相同浓度后在 96孔微量细胞板上进行倍比稀释，100μl/孔，使其稀释度分别为1:2、1:4、 1:8、1:16、1:32、1:64(100μl/孔)，每个稀释度重复4孔；取-80℃保存的 pcv2病毒液(tcid
50 10-7.75
/0.1ml)，将
其稀释为200个tcid
50
/ml，分别与不同稀释度的pcv2 cap蛋白双价纳米抗体等体积混合，37℃孵育1h，然后分别将作用后的纳抗和病毒混合物加入到长满单层的pk-15细胞中，置 37℃、5％co2培养箱中培养1h后弃掉，每孔补加100μl细胞维持液置37℃、 5％co2培养箱中培养。同时设置阴性血清对照、阳性血清对照、病毒对照和空白对照。
[0147]
抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体与pcv2病毒中和试验结果显示，抗 pcv2单价中和纳米抗体中和效价为1:8，双价纳米抗体稀释至25时仍然具有 pcv2中和活性，能保护pk-15细胞不产生病变(图16)。
[0148]
由上述实施例可知，本发明提供的一种抗pcv2中和纳米抗体、双价中和纳米抗体及制备方案，抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体具有较好的中和活性，能够实现高纯度抗pcv2 cap蛋白双价中和纳米抗体重组蛋白的工业化生产，为有效防控猪圆环病毒2型提供了新的手段和方法。
[0149]
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
[0150]
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。