一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用的制作方法

1.本发明涉及原生质体制备技术领域，具体涉及一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用。


背景技术：

2.原生质体是植物和部分微生物利用机械或者酶解的方式去除掉细胞壁得到的细胞组分。原生质体在植物和微生物中的应用非常广泛，对于分子和细胞生物学的理论和应用研究具有重要的意义。植物原生质体具有细胞全能性，有再分化、重新进入细胞周期、分化为组织或器官的潜能，在细胞瞬时转化、亚细胞定位、细胞融合和大分子复合物相互作用等方面具有重要的应用。微生物原生质体能够更容易被诱变，并且原生质体融合在优良菌株选育方面也发挥着重要的作用。
3.原生质体在制备过程中，因为要去除细胞壁，过程繁多，在这个过程中原生质体很容易破损而导致收集到完整的原生质体细胞很少，会影响着后续实验的进行和结果。在制备原生质体的过程中需要添加稳定剂来保持原生质体ph、细胞膜和大分子等物质的稳定。
4.目前在制备植物和微生物原生质体所使用的缓冲稳定剂有所不同。对于植物来说，主要的缓冲稳定剂为2-吗啉乙磺酸(mes)、甘露醇等物质；而在微生物原生质体的制备过程中，渗透压稳定剂则主要为蔗糖、山梨醇、氯化钾和硫酸镁等物质。稳定剂的选用对于原生质体内环境的平衡具有重要作用，选用不当会造成游离的原生质体破裂，制备出来的原生质体数量较少，并且存放时间较短，对后期原生质体再生及转化有很大的影响。


技术实现要素：

5.针对现阶段制备植物和微生物原生质体所使用的缓冲稳定剂有所不同，现有技术缺少能够同时应用于植物和微生物的原生质体制备过程的缓冲稳定剂的问题，本发明提供一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用，在缓冲稳定剂中加入小分子氨基酸衍生物依克多因(cas号：96702-03-3)，能够保护细胞在高盐、高温等极端条件下免受伤害，具有稳定渗透压、保护酶、dna、蛋白质和生物膜的作用；且所使用缓冲稳定剂适用于植物及微生物的原生质体制备过程，可减少制备过程中原生质体的损伤，达到收到更多完整的原生质体并延长原生质体存放时间，较长时间保持活性及不破裂的目的。
6.本发明采用以下技术方案：
7.一种含有依克多因的缓冲稳定剂在制备原生质体中的应用，所述缓冲稳定剂含有终浓度为0.02～0.2mol/l的依克多因和终浓度为0.1～0.2mmol/l的mgcl2。
8.进一步的，所述缓冲稳定剂中，依克多因的终浓度为0.16～0.2mol/l。
9.进一步的，所述缓冲稳定剂中，依克多因的终浓度为0.16mol/l。
10.进一步的，所述缓冲稳定剂中，mgcl2的终浓度为0.1～0.14mmol/l。
11.进一步的，所述缓冲稳定剂中，mgcl2的终浓度为0.14mmol/l。
12.进一步的，所述缓冲稳定剂的制备方法为配制终浓度的依克多因溶液，向依克多
因溶液中加入mgcl2得到混合溶液，使混合溶液中mgcl2浓度达到mgcl2终浓度要求，对混合溶液过滤除菌，得到所述缓冲稳定剂。
13.进一步的，所述原生质体为植物和/或微生物的原生质体。
14.进一步的，所述原生质体为拟南芥原生质体。
15.进一步的，所述原生质体为出芽短梗霉原生质体。
16.本发明的有益效果在于，本发明使用的含有终浓度为0.02～0.2mol/l的依克多因和终浓度为0.1～0.2mmol/l的mgcl2的缓冲稳定剂处理原生质体，从细胞壁酶解开始便为保护酶、细胞膜、胞内组分提供一个较为温和的缓冲稳定环境，使整个细胞处于一种保护和稳定的状态，在细胞壁消解过程中对细胞内环境的ph、原生质体组分都有保护和稳定作用，避免因为失去细胞壁而造成细胞损伤，保证了细胞的完整性和活性，能够非常有效地提升原生质体制备的数量和质量，长时间放置能够减少原生质体的破裂度和破裂数量，有利于后续实验的进行。
具体实施方式
17.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
18.实施例1
19.使用超纯水分别配制终浓度为0.02mol/l、0.1mol/l、0.16mol/l、0.2mol/l的依克多因溶液，向各份依克多因溶液中加入分别mgcl2得到混合溶液，使各混合溶液中mgcl2终浓度达到0.14mmol/l，用0.2μm过滤器过滤除菌得到缓冲稳定剂a1～4。
20.实施例2
21.使用超纯水配制4份终浓度为0.16mol/l的依克多因溶液，向4份依克多因溶液中加入mgcl2得到混合溶液，使混合溶液中mgcl2终浓度分别达到0.1mmol/l、0.14mmol/l、0.16mmol/l、0.2mmol/l，用0.2μm过滤器过滤除菌得到缓冲稳定剂b1～4。
22.对照例1
23.使用超纯水配制0.01mol/l的mes-koh溶液，并调ph为5.8～6.0，得到缓冲稳定剂ck1。
24.对照例2
25.使用超纯水配制浓度为0.8mol/l的甘露醇溶液，即为缓冲稳定剂ck2。
26.对照例3
27.用超纯水配制0.01mol/l的mes-koh溶液，并调ph为5.8～6.0，然后加入终浓度为0.8mol/l的甘露醇溶液，得到缓冲稳定剂ck3。
28.对照例4
29.以2mol/l山梨醇作为缓冲稳定剂ck4。
30.对照例5
31.以1mol/l蔗糖溶液作为缓冲稳定剂ck5。
32.实施例3拟南芥原生质体保护测试
33.①
向适量超纯水中加入200μl浓度为0.5mol/l的mes及20g/l的纤维素酶和2.5g/l的离析酶，完全溶解后55℃水浴加热15分钟，冷却至室温，然后向溶液中分别加入缓冲稳定剂a1～4、b1～4及ck1～3各10ml，每份酶解液用超纯水定容至20ml，然后用0.2μm过滤器过滤除菌待用。
34.②
从前期培养的3-5片叶拟南芥幼苗中挑选幼嫩叶片，轻轻切成1～2mm长条，放入装有酶解液的培养皿中，然后抽真空2分钟，再把培养皿置于20～25℃的摇床(40rpm)中避光培养2～3小时。
35.③
将含有原生质体的酶解液轻轻过滤至50ml离心管中，60
×
g离心5分钟收集原生质体(加速、减速均为0)，使用10ml预冷的对应的各稀释2倍的缓冲稳定剂清洗2次，操作柔和，避免破坏细胞，然后加入10ml对应的各稀释2倍的缓冲稳定剂重悬原生质体并在冰上放置半小时，然后用血球计数板计数并测算原生质体浓度，随后放在4℃保存备用，后又对放置6h、12h、18h的进行血球计数板计数并测算原生质体浓度。
36.实验结果如下表1所示，在制备拟南芥原生质体时，缓冲稳定剂中依克多因终浓度为0.16mol/l、mgcl2终浓度为0.14mmol/l时，原生质体数量最多，长时间保存也能够保证其数量。
37.表1拟南芥完整原生质体浓度(个/ml)
[0038][0039][0040]
实施例4出芽短梗霉原生质体保护测试
[0041]
①
先配好含有100mmol/l tris、10mmol/l edta的溶液10ml，再加入20g/l的纤维素酶和2g/l的蜗牛酶，然后向溶液中分别加入缓冲稳定剂a1～4、b1～4及ck4～5各10ml，然后用0.2μm过滤器过滤除菌得到酶解液待用，每份酶解液的体积为20ml。
[0042]
②
取培养12～15h处于对数生长期的酵母状出芽短梗霉菌液2ml于5ml离心管中，4000r/min离心10分钟，弃上清，收集菌体，用5mmol/l的edta溶液洗涤两次，然后加入2ml溶
有35mmol/lβ-巯基乙醇、5mmol/l edta的溶液在30℃、150r/min条件下处理1h，之后4000r/min离心10分钟，弃上清，再用5mmol/l的edta溶液洗涤两次，然后加入酶解液30℃恒温水浴6小时，然后过滤收集原生质体，加入等量稀释2倍的缓冲稳定剂重悬至适宜浓度，置于冰上，用血球计数板计数并测算原生质体浓度，随后放在4℃保存备用，后又对放置6h、12h、18h的进行血球计数板计数并测算原生质体浓度。
[0043]
实验结果如下表2所示，在制备出芽短梗霉原生质体时，缓冲稳定剂中依克多因终浓度为0.16mol/l、mgcl2终浓度为0.14mmol/l时，原生质体数量最多，长时间保存也能够保证其数量。
[0044]
表2出芽短梗霉完整原生质体浓度(个/ml)
[0045][0046]
综上所述，含有依克多因的缓冲稳定剂用于制备原生质体时，对于原生质体具有很好的保护作用，能够增加原生质体的保存时间，在植物和微生物制备原生质体时具有重要的应用价值，为后续实验的顺利开展打下了基础。
[0047]
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。