一种白术内生真菌、发酵产物及其应用

1.本发明涉及植物病害防控技术领域，具体地说，是一种白术内生真菌及其发酵产物在抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性中的应用。


背景技术：

2.中药白术为菊科植物白术atractylodes macrocephala koidz.的干燥根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，性温，味甘，入脾、胃经，具健脾益气，燥湿利水，止汗安胎等功效，用于脾虚食少，痰饮眩悸，腹胀泄泻，水肿，自汗，胎动不安等症。现代药理研究表明，白术具有保肝，调节胃肠运动、调节便秘、调节溃疡性急肠炎、调节免疫功能、调节脂代谢，抗炎抗肿瘤，降血糖等作用。
3.根腐病是白术栽培生产中最主要的土传性病害之一，危害严重，是白术生产种植链中亟待解决的问题。白术根腐病病原菌为复合性病原菌，主要为镰刀菌属真菌，包括尖孢镰刀菌 (fusarium oxysporum)、半裸镰刀菌(fusarium incarnatum)等。目前，在栽培管理中白术根腐病主要依靠化学农药防治，易导致环境污染、农药残留以及产生抗药性等问题。
4.内生真菌是指生活史的某一个阶段能侵染定殖在健康植物组织内部，并且不会引起宿主植物明显病症的一类真菌。研究表明，几乎所有的植物体内都存在着植物内生真菌，植物内生真菌与宿主植物协同进化，互惠共生。植物内生真菌往往对植物病原菌具有一定拮抗作用，如有学者研究发现苦参内生真菌bs001(aspergillu terreus)菌株对产气肠细菌和黄瓜枯萎病菌具有显著的抑菌效果，bs001菌株发酵液中的抗菌活性物质能抑制黄瓜枯萎病菌丝的生长，同时抑制孢子萌发，对黄瓜枯萎病病原菌合成梭甲基纤维素酶有抑制作用，并且可以使细胞膜结构受损，从而能很好的抑制黄瓜枯萎病。从丹参中分离筛选得到的拟茎点霉属真菌phomopsis sp.s4，其发酵液提取物对稻瘟病菌丝的细胞壁造成了破坏，从而干扰了菌丝正常的生理功能，进而抑制了稻瘟病菌的生长。因此，植物内生真菌发酵产物是植物病害防控技术领域重要资源。
5.但是，关于白术内生真菌发酵产物抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性作用目前鲜有报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种白术内生真菌、发酵产物及其在抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性中的应用。
7.本发明的第一方面，提供了一种植物内生真菌，所述内生真菌是从菊科苍术属植物白术 atractylodes macrocephala koidz.活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，命名为拟茎点霉菌am569(phomopsis sp.)。该菌株已保藏，菌株保藏号为cgmcc no.21947，保藏日期为2021年4月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
8.本发明所述的内生真菌的固体培养特征为：
9.在土豆葡萄糖琼脂培养基(pda)上26℃黑暗培养，菌株生长速度较快，菌落呈灰白色，菌体短绒毛状，中心白色菌丝稍多，绒毛状明显，外圈菌丝多灰色，贴板生长，菌丝直径2.1～6.5 μm，菌丝有明显分隔。
10.本发明所述的内生真菌的its扩增碱基序列如seq id no.1所示，将测序结果于ncbi 网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，同phomopsis asparagi(kx866925) 与phomopsis eucommii(ay601921)同源性均达99％。用mega 7.0软件做序列比对，用邻接法(neighbor-joining，nj)分析，随机挑选1个序列，重复比对1000次。本发明所述内生真菌的系统进化树见图3。
11.本发明所述的内生真菌发酵产物首先是在pda固体培养基上进行am569菌株活化，然后打取5mm菌饼放入pdb液体培养基中于摇床中黑暗培养，8d后收集菌丝与发酵滤液，分别用甲醇与乙酸乙酯提取(萃取)，旋蒸至浸膏状，甲醇与dmso溶解所得，如图4所示。固体培养基(pda)的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水，15g琼脂，ph 自然。液体培养基(pdb)的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水，ph自然。
12.本发明的第二方面，提供了上述内生真菌发酵产物在抑制白术根腐病病原菌生长和/或增强白术对根腐病的抗性中的应用。
13.所述的上述应用，内生真菌am569发酵产物能抑制白术根腐病病原菌尖孢镰刀菌 (fusarium oxysporum)和半裸镰刀菌(fusarium incarnatum)的生长。
14.上述应用，主要通过以下技术方案来实现的：(1)取上述的内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的土豆葡萄糖培养基(配方为土豆200g，葡萄糖 20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然)，26℃，65％湿度条件下暗培养7d；(2)无菌条件下，用5mm的打孔器打取上述菌株菌落边缘的菌块，转接于含有50ml的pdb培养基中，在26℃、180r/min恒温条件下摇床震荡培养8d；(3)将发酵产物抽滤得到发酵滤液与菌丝，将菌丝烘干(50℃)称量后，粉碎菌丝制成粉末，以甲醇(ml)：菌丝(g)＝20：1 的比例超声提取1h，抽滤得菌丝提取液；(4)将发酵滤液以乙酸乙酯：菌液＝1：1的比例萃取三次，蒸干，将菌丝提取液与萃取蒸发后的发酵滤液混合，适量甲醇超声溶解，旋蒸至浸膏状，加入适量dmso溶液，用甲醇定容至10ml，即得内生真菌发酵产物；(5)采用添加发酵产物至培养基的方式，对生长在pda平板上的病原菌进行抑制培养，浓度为10mg/ml，培养周期为7d，能有效抑制白术根腐病病原菌的生长，如图5所示；(6)采用灌根的方式施用am569发酵产物，浓度为0.01mg/ml，施用量为2ml/次/d，持续7d，能降低白术根腐病病情指数82.16％，如图6所示。
15.本发明优点在于：
16.本发明所述的内生真菌拟茎点霉菌am569，通过液体培养基制备的发酵产物，能有效抑制白术根腐病病原的生长，增强白术对根腐病的抗性。拟茎点霉菌am569对白术根腐病的生物防治作用在农业领域内的推广具有巨大的价值。
附图说明
17.图1：拟茎点霉菌am569(phomopsis sp.)在pda固体培养基上的菌落形态；
18.图2：拟茎点霉菌am569(phomopsis sp.)在光学显微镜下的菌丝形态(10
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40)；
19.图3：基于its4和its5引物扩增的am569(phomopsis sp.)系统进化树(nj法)；
20.图4：拟茎点霉菌am569(phomopsis sp.)发酵产物；
21.图5：拟茎点霉菌am569(phomopsis sp.)发酵产物对白术根腐病病原菌的抑菌作用(a) 及统计结果图(b)；
22.图6：拟茎点霉菌am569(phomopsis sp.)发酵产物增强白术对根腐病的抗性结果图。
具体实施方式
23.本发明的内生真菌是从浙江省临安区於潜镇的白术活体中分离得到的菌株。
24.实施案例1：
25.所述的内生真菌按以下步骤分离获得：用清水快速冲洗白术块根表面的泥土和杂质，冲洗干净后，滤纸吸干表面的水分，按照75％乙醇1min，2.5％次氯酸钠5min，75％乙醇1min 进行表面消毒后，用灭过菌的滤纸吸干水分，然后用消毒的解剖刀将块根切成小的组织块(0.5 cm
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0.5cm)，随机挑取组织块，每4个为一组置于含有青霉素(50mg/l)的pda培养基的平板中。密封后26℃培养，定期观察内生真菌菌丝的生长和菌落的形成，经过不断分离纯化培养至单一菌落。根据菌丝的形态和群落的培养特征将单一菌落的内生真菌划分为不同的形态型。最终得到本发明的内生真菌菌株am569，如图1-2所示，在土豆葡萄糖琼脂培养基 (pda)上26℃黑暗培养，菌株生长速度较快，菌落呈灰白色，菌体短绒毛状，中心白色菌丝稍多，绒毛状明显，外圈菌丝多灰色，贴板生长，菌丝直径2.1～6.5μm，菌丝有明显分隔；于4℃低温保存。
26.取am569菌株的冻存管，在无菌条件下，用消毒后的接种针挑取适量菌丝置于新配制的pda培养基中活化，26℃遮光培养至成熟。按照真菌基因组dna提取试剂盒的指示说明，提取am569的基因组dna。以am569的基因组dna为模板，采用引物its4 (5
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ggaagtaaaagtcgtaagg-3’)和its5(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)进行 pcr扩增。pcr反应体系(50μl)组成为：模板dna，2μl；引物its4，1μl；引物its5， 1μl；2
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tappcr mastermix(含染液)，25μl；ddh2o，21μl。pcr反应循环条件：95℃初始变性3min；94℃变性40s；52℃退火50s；72℃延伸1min；变性-退火-延伸循环35次；最后72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物有限公司进行序列测定。以pcr产物测得序列作为靶序列，在ncbi中的genbank数据库搜索同源序列，结果表明同phomopsis asparagi(kx866925)与phomopsis eucommii(ay601921)同源性均达99％。下载与形态型序列最相似的参考序列，用邻接法(neighbor-joining，nj)用于系统发育分析，来确定待鉴定菌株的系统发育地位，如图3所示。本发明的内生真菌是子囊菌门间座壳菌目黑腐皮壳科，分类命名为拟茎点霉菌am569(phomopsis sp.)，菌株保藏编号为cgmcc no. 21947。
27.实施例2：
28.取am569菌株的冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的土豆葡萄糖培养基(配方为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然)，26℃， 65％湿度条件下暗培养7d；无菌条件下，用5mm的打孔器打取上述菌株菌落边缘的菌块，转接于含有50ml的pdb培养基中，在26℃、180r/min恒温条件下摇床震荡培养8d；将发酵产物抽滤得到发酵滤液与菌丝，将菌丝烘干(50℃)称量后，粉碎菌丝制成粉末，以甲醇 (ml)：菌丝(g)＝20：1的比例超声提取1h，抽滤得菌丝提取液；将发酵滤液以乙酸乙酯：菌液＝1：1的比例萃取三次，蒸干，将菌丝提取液与萃取蒸发后的发酵滤液混合，适量甲醇超声溶解，旋
蒸至浸膏状，加入2ml dmso溶液，用甲醇定容至10ml，即得内生真菌发酵产物，如图4所示；采用添加发酵产物至培养基的方式(以无菌水为空白对照、等量甲醇 +dmso为阴性对照、多菌灵为阳性对照)，对生长在pda平板上的病原菌进行抑制培养，浓度为10mg/ml，培养周期为7d，am569对白术根腐病病原菌尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌的抑制率均达到100％，能完全抑制白术根腐病病原菌的生长，抑菌率显著高于阳性对照多菌灵处理组，如图5所示。
29.实施例3：
30.取白术根腐病病原菌尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的土豆葡萄糖培养基(配方为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然)，26℃，65％湿度条件下暗培养5d；无菌条件下，用5mm的打孔器打取上述菌株菌落边缘的菌块，转接于含有50ml的pdb培养基中，在26℃、180r/min恒温条件下摇床震荡培养5d，用4层无菌纱布过滤，取滤液，将尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌的混合菌悬液等比例混合，并调至od600＝0.6～1.0，即得病原菌菌悬液。取长至5cm高的白术幼苗，用无菌刀在主根上划2-3cm伤口，在上述病原菌混合菌悬液中浸泡10min，黑暗条件， 26℃下培养48h，即完成病原菌接种。设模型组(病原菌接种+无菌水)、am569处理组(病原菌接种+am569发酵产物0.01mg/ml)、阳性药组(病原菌接种+多菌灵1000倍液)，以健康白术+等体积蒸馏水为对照组，n＝30，am569发酵产物处理组采用灌根的方式施加于白术上，施用量为2ml/次/d，持续7d后计算病情指数(di)采用公式di＝[σ(病级株数
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代表数值)/株数总和
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发病最高级代表数值]
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100计算。能显著降低白术根腐病病情指数82.16％ (
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p《0.01)，防治效果优于阳性药组，如图6所示。
[0031]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。