一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法

1.本发明涉及一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，该免疫凝集素能够提高球孢白僵菌对棉铃虫的杀伤效率，作为棉铃虫防治的靶标，属于生物技术领域。


背景技术：

2.棉铃虫是一种广食性的鳞翅目害虫，取食包括棉花在内的200多种植物，给农业带来了巨大的损失。传统的化学农药防治方法，会使棉铃虫产生抗药性，同时造成严重的环境问题。生物防治因其对害虫的特异性和对环境的友好性，日渐成为备受关注的害虫防治策略。以球孢白僵菌为代表的虫生真菌是目前应用广泛的生物防治因子，其能够感染超过700种昆虫，同时对环境和人等温血动物无害，培养成本低，致病力强。球孢白僵菌对昆虫的感染首先要完成对昆虫体表的附着，附着后的孢子会在昆虫体表萌发，并形成附着胞，随后，真菌会分泌多种酶类（如几丁质酶、脂酶和蛋白酶等）破坏昆虫表皮的完整性，使孢子进入昆虫体内（butt et al.，2016），并在其中繁殖，同时产生多种毒力因子，作用于昆虫的免疫、代谢等多个生理过程，使之紊乱、失调，最终引起昆虫死亡（cen et al.，2017；valero
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jimenez et al.，2016）。棉铃虫的免疫系统能对真菌等病原物进行识别，并将信息传递至效应细胞，产生免疫效应。免疫凝集素（ctl）是一类重要的免疫识别分子，可通过与病原表面特定糖基的相互作用，识别并结合“非己”物质，是宿主启动免疫反应的第一步。目前已知的棉铃虫ctl的功能主要表现为通过对病原物的凝集，降低其致病性，同时激活宿主的细胞免疫和体液免疫，诱发包囊和吞噬反应，诱导抗菌肽的表达，对病原进行一定程度的杀伤，从而降低真菌等病原物对宿主的危害，保证宿主存活（wang et al.，2017；cheng et al.，2017）。本发明所涉及的免疫凝集素能显著提高球孢白僵菌对棉铃虫的杀伤力，在保证安全的情况下，增强现有生物农药对害虫的杀灭效果，可以降低农药的使用量，节省农业生产的成本。


技术实现要素：

3.本发明的目的是针对上述存在的问题，利用快速克隆技术，将棉铃虫ctl26克隆到pet
‑
28a载体，在体外获得了有活性的重组蛋白，通过感染实验，发现重组ctl26能显著提高球孢白僵菌对棉铃虫的杀伤效率。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，其特征是，包括以下步骤：步骤（1）、获得pet
‑
28a
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ctl26原核表达载体；提取棉铃虫的脂肪体总rna，并反转录为cdna，以cdna为模板，进行pcr扩增，所用上游引物序列为gcatgactggtggacagaagcctgattacttgtacga，下游引物序列为ctagttattg
ctcagcggtttctgtgtagatcttccaaa，得到的目的片段；经测序后确定为ctl26；然后，利用无缝克隆方法，获得pet
‑
28a
‑
ctl26原核表达载体；步骤（2）、将pet
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28a
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ctl26原核表达载体转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中培养，挑取单菌落，转接培养，加入iptg诱导，离心得到含有ctl26蛋白的上清液，经ni亲和层析柱纯化和超滤提纯后，获得变性的ctl26重组蛋白。
5.2. 根据权利要求1所述的一种提高球孢白僵菌对棉铃虫杀伤效率的免疫凝集素的制备方法，其特征是，步骤（1）中，获得的ctl26的cdna序列入下：atgttaacaatatatttaatttgtttgtcatatttgttgattgcaactggtcccgtgcgatgcaagcctgattacttgtacgacagtgaagtgcagggctggctcaagcttcacgtgattccagcaacgtgggagcaagcggttttgcgctgtcactatgaaggagcagtgctggcgtctccacttaacgaagagctgaccaaagctctccactcaacaatgacaaagtttggtatcaatcgttgcatcttcttgggtaccagtttgttgctctccaatggcgacttcgtttcaatagaaggcgtcccactgtctgaccaggagatacagtggagcccacaagggcccgatccaggacaatgcctcaccatggccatctctggcagcgagcacttcatgtataccgcgtcatgcgacgaacaactaccctacatatgctatagaaatcatgacaatagtactatgaatgaatgtggcacatttgacaacaaataccactacaatcagaaaactggcagctgttacaaagtccacaacgagaaacacacctggtaccgcgcaaatatgatctgctttgcggagggaggtcatctcgtcatcctgaatgatgacgtgaaagctaacatcgtcaaggatatgttccccgttcgtaccgataacacgacgaatttatgggagcaaatccacatcggtctaaaagcctgggacgaccgcatatggtttaccattcacggtgataaaatagacgatgtgtacaaccaatgggctgcaggacaaccagacaataagatgggcacacaaaatattggtactattcttcggagtggcctcttggatgatgcaaatcctctcaaacggaacatgtttgtgtgcgagaaagcagctcataaaatacgcttcgaatctccaaaattgcgatggaatgaattaattgtaccttttggaagatctacacagaaataa；以上cdna序列对应的蛋白质序列入下：mltiyliclsylliatgpvrckpdylydsevqgwlklhvipatweqavlrchyegavlasplneeltkalhstmtkfginrciflgtslllsngdfvsiegvplsdqeiqwspqgpdpgqcltmaisgsehfmytascdeqlpyicyrnhdnstmnecgtfdnkyhynqktgscykvhnekhtwyranmicfaegghlvilnddvkanivkdmfpvrtdnttnlweqihiglkawddriwftihgdkiddvynqwaagqpdnkmgtqnigtilrsgllddanplkrnmfvcekaahkirfespklrwnelivpfgrstqk。
6.对变性的ctl26重组蛋白的复性与活性检测方法为：首先，使用透析袋和蛋白复性溶液对变性的ctl26重组蛋白进行多次梯度复性，获得可溶性蛋白；最后，通过凝集、结合和包囊实验分析其对球孢白僵菌的识别活性。
7.真菌感染实验方法，其具体步骤为：取大小一致的三龄棉铃虫分成四组，利用显微注射的方法，分别注射pbs、真菌孢子、针对ctl26的双链rna和真菌孢子以及ctl26重组蛋白孵育后的真菌孢子，记录幼虫死亡情况，分析存活率。
8.本发明方法先进科学，通过本发明，采用的技术方案为：1、ctl26重组蛋白的表达与纯化的方法，其具体步骤为:首先获得pet
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28a
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ctl26原核表达载体，转化至bl21感受态细胞中培养，挑取单菌落，转接培养，加入iptg诱导，离心得到含有ctl26蛋白的上清液，经ni亲和层析柱纯化和超滤提纯后，获得变性的ctl26重组蛋白。
9.2、重组ctl26的复性与活性检测方法，其具体步骤为：首先，使用透析袋和蛋白复
性溶液对上述变性的ctl26蛋白进行多次梯度复性，获得可溶性蛋白；最后，通过凝集、结合和包囊实验分析其对球孢白僵菌的识别活性。
10.3、真菌感染实验方法，其具体步骤为：取大小一致的三龄棉铃虫分成四组，利用显微注射的方法，分别注射pbs、真菌孢子、针对ctl26的双链rna和真菌孢子以及ctl26重组蛋白孵育后的真菌孢子，记录幼虫死亡情况，分析存活率。
11.本发明通过显微注射的方式，对棉铃虫幼虫进行了感染实验，发现球孢白僵菌能对棉铃虫进行有效的杀伤，而使用重组ctl26处理的球孢白僵菌，对棉铃虫的杀伤效率显著提高，该蛋白为新型生物农药的研制提供了可用的靶标。
12.本发明利用快速克隆技术，将棉铃虫ctl26克隆到pet
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28a载体，在体外获得了有活性的重组蛋白。通过显微注射的方式，对棉铃虫幼虫进行了感染实验，发现球孢白僵菌能对棉铃虫进行有效的杀伤，而使用重组ctl26处理的球孢白僵菌，对棉铃虫的杀伤效率显著提高，该蛋白为新型生物农药的研制提供了可用的靶标。
13.目前市场上使用的农药以化学农药为主，但化学农药已经被证实存在明细的弊端，因此使用生物农药替代化学农药是未来发展的趋势。2020年全球生物农药的销售额超过50亿美元，占全部农药市场的份额不到10%，发展前景广阔。在我国的生物农药中，2020年微生物（细菌、真菌和病毒）农药占比38%，其中球孢白僵菌杀虫剂登记数为25个，仅次于苏云金芽孢杆菌，是我国的第二大微生物农药。本发明所涉及的棉铃虫免疫凝集素ctl26能提高球孢白僵菌对害虫的杀伤效率，具有实际的经济效益。
附图说明
14.图1是本发明中ctl26扩增电泳图；图2是本发明中重组ctl26的纯化与复性；图3是本发明重组ctl26对球孢白僵菌的凝集；图4是本发明中重组ctl26对球孢白僵菌的结合；图5是本发明中重组ctl26促进血细胞对色谱珠的包囊作用；图6是本发明中真菌感染棉铃虫的存活分析。
具体实施方式
15.下面结合附图以及附图说明对本发明做进一步说明。
16.实施例一：ctl26重组蛋白的表达与纯化的方法，具体步骤如下：1. 获得pet28a
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ctl26原核表达载体：1.1提取棉铃虫的脂肪体总rna，并反转录为cdna，以cdna为模板，进行pcr扩增，所用上游引物和下游引物序列分别为gcatgactggtggacagaagcctgattacttgtacga和ctagttattgctcagcggtttctgtgtagatcttccaaa，得到的目的片段如图1所示；经测序后确定为ctl26。
17.1.2利用无缝克隆方法，获得pet28a
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ctl26原核表达载体；2. pet28a
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ctl26重组蛋白原核表达：2.1将获得的pet28a
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ctl26原核表达载体，转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中，经过培养，挑取单菌落，扩大培养。
18.2.2 当培养基的od600值达到0.5左右时，向培养基中加入iptg，使iptg终浓度为
0.3mmol/l，37℃诱导ctl26蛋白表达4h。
19.2.3 取上述步骤制得的菌液，离心弃上清。在沉淀中加入一定体积的binding buffer混匀，进行超声裂解，离心得到含有ctl26蛋白的上清液。
20.2.4 将上述得到含有ctl26蛋白的上清液加到含有ni
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agarose resin填料的层析柱中，使用15倍体积的binding buffer冲洗层析柱，洗去杂蛋白，再依次使用适量的elution buffer洗脱，收集洗脱液，使用sds
‑
page检测洗脱液，如图2；收集条带单一的洗脱液，用超滤法去除部分杂质，并对蛋白进行浓缩。
21.实施例二：ctl26重组蛋白复性与活性检测，具体步骤如下：1. 重组蛋白ctl26复性具体步骤如下：1.1使用2% nahco3和1mm edta对透析袋进行预处理。
22.1.2 配制蛋白复性溶液，步骤如下：tris hcl：20mm；nacl：150mm；还原型谷胱甘肽：2mm；氧化型谷胱甘肽：0.02mm；甘油：5%（v/v）；tween
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20：0.005%（v/v）；尿素：3m；tris hcl：20mm；nacl：150mm；还原型谷胱甘肽：2mm；氧化型谷胱甘肽：0.02mm；甘油：5%（v/v）；tween
‑
20：0.005%（v/v）；尿素：1m；tris hcl：20mm；nacl：150mm；还原型谷胱甘肽：2mm；氧化型谷胱甘肽：0.02mm；甘油：5%（v/v）；tween
‑
20：0.005%（v/v）；尿素：0m。
23.1.3 使用透析袋和蛋白复性溶液对上述获得的ctl26蛋白进行透析复性，透析分三步进行，且均在4℃进行。
24.1.4 蛋白复性后，使用bca测定蛋白浓度，经计算，复性率约为60%，且利用sds
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page观察蛋白是否降解，如图2。
25.2. 重组蛋白ctl26活性检测具体步骤如下：取表达绿色荧光蛋白gfp的球孢白僵菌孢子，制备悬液，使用血球计数板计数得到孢子悬液的浓度为1
×
108个/ml。
26.2.1 凝集实验：取10μl制备好的孢子悬液，向其中加入ctl26重组蛋白10μg，然后加入终浓度为2mm的cacl2或cacl2与ctl26多克隆抗体的混合物，同时以牛血清白蛋白(bsa)替换目的蛋白，作为对照组，加pbs至50μl，室温放置30min，使用荧光显微镜观察球孢白僵菌的凝集情况。如图3所示，bsa对孢子没有凝集作用，在没cacl2存在时，ctl26对孢子也几乎没有凝集作用，而加入cacl2后ctl26对孢子产生了明显的凝集作用，同时，ctl26的抗体能中和其对真菌的凝集。
27.2.2 结合实验：在100μl球孢白僵菌菌悬液中加入ctl26重组蛋白100ug，室温旋转孵育45min后，先用无菌pbs洗去未结合的蛋白，再用1%的sds将结合在菌体表面的ctl26重组蛋白洗脱下来，使用ctl26抗体检测洗脱液中是否存在相应的重组蛋白。结果显示ctl26能有效结合到真菌孢子上，如图4。
28.2.3 包囊实验：取少量色谱珠，用tbs洗三次，在tbs中悬浮，并加入cacl2至浓度为10mm；加10μg ctl26重组蛋白或bsa，4℃过夜后，用tbs洗5次；取5龄幼虫血细胞，用tbs重悬后至每毫升细
胞个数为3
×
106个，与重组蛋白或bsa包被的色谱珠混合，室温孵育过夜。收集色谱珠，用tbs重悬后，在显微镜下观察血细胞对色谱珠的包囊情况，结果显示血细胞对bsa包被的色谱珠几乎没有包囊反应，而对ctl26包被的色谱珠有明显的包囊反应，包囊率约为66%，如图5。
29.实施例三：球孢白僵菌菌感染棉铃虫实验，具体步骤如下：1. 使用体外转录方式合成针对ctl26和gfp的双链rna，并注射2ug ctl26 或gfp的双链rna至2龄末期幼虫。
30.2. 24小时后，注射10nl球孢白僵菌孢子（1
×
107个/ml）或pbs至以上棉铃虫，每组24只，记录不同时间点幼虫死亡情况。
31.3. 在50ul球孢白僵菌（1
×
107个）菌液中加入ctl26重组蛋白10ug，室温放置1h后，注射混悬液至预先注射gfp双链rna的棉铃虫中，记录幼虫死亡情况，分析不同组的存活率。如图6所示，干扰ctl26的表达能降低棉铃虫的死亡率，而重组ctl26能提高棉铃虫的死亡率。
32.实施例一、二、三中，获得的ctl26的cdna序列入下：atgttaacaatatatttaatttgtttgtcatatttgttgattgcaactggtcccgtgcgatgcaagcctgattacttgtacgacagtgaagtgcagggctggctcaagcttcacgtgattccagcaacgtgggagcaagcggttttgcgctgtcactatgaaggagcagtgctggcgtctccacttaacgaagagctgaccaaagctctccactcaacaatgacaaagtttggtatcaatcgttgcatcttcttgggtaccagtttgttgctctccaatggcgacttcgtttcaatagaaggcgtcccactgtctgaccaggagatacagtggagcccacaagggcccgatccaggacaatgcctcaccatggccatctctggcagcgagcacttcatgtataccgcgtcatgcgacgaacaactaccctacatatgctatagaaatcatgacaatagtactatgaatgaatgtggcacatttgacaacaaataccactacaatcagaaaactggcagctgttacaaagtccacaacgagaaacacacctggtaccgcgcaaatatgatctgctttgcggagggaggtcatctcgtcatcctgaatgatgacgtgaaagctaacatcgtcaaggatatgttccccgttcgtaccgataacacgacgaatttatgggagcaaatccacatcggtctaaaagcctgggacgaccgcatatggtttaccattcacggtgataaaatagacgatgtgtacaaccaatgggctgcaggacaaccagacaataagatgggcacacaaaatattggtactattcttcggagtggcctcttggatgatgcaaatcctctcaaacggaacatgtttgtgtgcgagaaagcagctcataaaatacgcttcgaatctccaaaattgcgatggaatgaattaattgtaccttttggaagatctacacagaaataa；以上cdna序列对应的蛋白质序列入下：mltiyliclsylliatgpvrckpdylydsevqgwlklhvipatweqavlrchyegavlasplneeltkalhstmtkfginrciflgtslllsngdfvsiegvplsdqeiqwspqgpdpgqcltmaisgsehfmytascdeqlpyicyrnhdnstmnecgtfdnkyhynqktgscykvhnekhtwyranmicfaegghlvilnddvkanivkdmfpvrtdnttnlweqihiglkawddriwftihgdkiddvynqwaagqpdnkmgtqnigtilrsgllddanplkrnmfvcekaahkirfespklrwnelivpfgrstqk。